RPHPLC柱前衍生法测定复方甘草酸铵S分散片的含量.docVIP

RP-HPLC柱前衍生法测定复方甘草酸铵S分散片的含量 作者：周海婴 作者单位：湖南省长沙市宁乡县人民医院药剂科，湖南 长沙 410600 【摘要】 目的：建立复方甘草酸铵S分散片中甘氨酸和蛋氨酸的高效液相分析方法。方法：采用柱前衍生化高效液相色谱法测定复方甘草酸铵S分散片中两种氨基酸含量。结果：复方甘草酸铵S分散片中甘氨酸浓度为10.58～39.68 mg/ml，蛋氨酸浓度为10.44～39.15mg/ml，线性关系良好，r＞0.99,RSD＜1.0%,加样回收率为99%。结论：用HPLC柱前衍生方法测定复方甘草酸铵S分散片中甘氨酸及蛋氨酸含量的方法可行。 【关键词】 高效液相法；复方甘草酸铵；分散片 由于甘氨酸与蛋氨酸的分子结构中都没有共轭结构，无紫外吸收，很难直接建立HPLC法检测本品的含量，原复方甘草甜素片的进口注册标准（J收载甘氨酸的含量测定方法为薄层扫描，蛋氨酸的含量测定方法为滴定法。虽然，薄层扫描法和滴定法均能满足本品中氨基酸含量测定的要求，但这些方法用于制剂的含量测定，还是存在一些不足和局限性，如滴定法受辅料的干扰大，终点颜色难以确定；薄层扫描法具有操作要求高，重复性不好，误差大等缺点。目前国家标准中收载的氨基酸含量测定方法几乎都是采用专门的氨基酸分析测定仪，但该设备价格较高，检测成本高，作为药品的检测方法很难推广。本研究现参照国内外相关文献报道，拟采用2-4-二硝基氟苯柱前衍生后，经高效液相色谱进行分离和同时检测两种氨基酸的含量，试图建立一种适应更广，稳定性更高，重复性更好的含量检测方法［1］。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 ：岛津LC-10AT型高效液相色谱仪，SPD-10A紫外检测器。色谱工作站：浙江大学N2000色谱管理系统。色谱柱：大连依利特Hypersil C18柱（4.6mm×200mm），粒度5Μm；检测波长：360nm；流速：1.5ml/min；柱温：室温。2-4-二硝基氟苯：分析纯。复方甘草酸铵S分散片（湖南华钠大药厂）。 1.2 方法 1.2.1 供试品溶液的配置：取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于甘氨酸25mg与蛋氨酸25mg），置100ml量瓶中，加水适量，超声处理25min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1.0ml，置10ml量瓶中，加0.05mmol/L碳酸氢钠溶液（pH 9.0）1.0ml及0.5% 2-4-二硝基氟苯的乙腈溶液1.0ml，置60℃水浴中暗处反应60min，取出，放冷，用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）稀释至刻度，放置15min，作为供试品溶液。 1.2.2 对照品溶液的配置：分别取甘氨酸与蛋氨酸对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含甘氨酸与蛋氨酸都为0.25mg的对照品混合溶液，从精密量取该溶液1.0ml起，同供试品溶液依法操作制得对照品溶液。 1.2.3 测定法：精密量取上述各溶液10Μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积分别计算甘氨酸和蛋氨酸的含量。 1.2.4 专属性试验：取供试品溶液精密量取该溶液10Μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。 1.2.5 阴性干扰试验：称取处方量的空白辅料（约相当于甘氨酸25mg与蛋氨酸25mg），置100ml量瓶中，从加水适量起同专属性试验项下供试溶液依法制得空白溶液，精密量取该溶液10Μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图。 1.2.6 线性相关性试验：分别精密称取甘氨酸与蛋氨酸对照品适量，置100ml量瓶中，从加水适量起同专属性试验项下供试溶液依法制得甘氨酸与蛋氨酸浓度都约为10、15、20、25、30、38Μg/ml的对照品混合溶液。分别精密量取上述溶液10Μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图。以浓度（Μg/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线图并进行线性回归。 1.2.7 精密度试验：取040405批样品，研细，称取样品适量（约相当于甘氨酸25mg与蛋氨酸25mg），按前法配制，作为供试品溶液，精密量取该溶液10Μl注入液相色谱仪，重复进样6次。 1.2.8 重复性试验：取040405批样品，研细，称取样品适量（约相当于甘氨酸25mg与蛋氨酸25mg），共6份，置100ml量瓶中，从加水适量起同精密度试验项下供试溶液方法同法制得供试品溶液；同法配制成每1ml中约含有甘氨酸与蛋氨酸都为0.25mg的对照品混合溶液，从精密量取该溶液1.0ml起，同供试品溶液依法操作制得对照品溶液。精密量取上述溶液各1