中枢和外周神经损伤在神经生理研究中的应用.docVIP

中枢和外周神经损伤在神经生理研究中的应用 损伤技术是神经生理学研究中的一项重要技术。中枢神经系统中不同类型神经元的相互联系、它们在功能上的相互影响、外周神经中不同神经纤维在传递信息中的作用，直至神经纤维中髓鞘膜生理等的研究，都需要在一定的条件下采用损毁其中某些核团或某一类型神经纤维的结构。在特别的情况下，如神经元的体外培养或在低等动物的神经节中，需要杀死某一鉴定的单个神经元，观察在缺乏某一类神经成分的情况下剩下的神经结构的功能活动的变化，以此来推论被损毁的神经结构的功能，是一种最为简单而又直接的方法。 一、电解损毁 在神经生理学中，应用电解损毁是一种最为常见的方法。电解损毁的最大优点是简便，在一定范围内神经损毁彻底。通常用一支不锈钢针电极，除尖端外插入神经组织的针柄皆都绝缘，绝缘的好坏关系到电解部位的准确性和可靠性。达到好的绝缘并不难，因为作为损伤的直流电压都很低，绝缘的可靠性用普通电表即可检查，简单的方法是用细铜丝弯成直径4～5mm的圆环，固定在电表一探头上，当铜丝环浸入生理溶液取出，便可形成一层盐水膜，电表的另一探头和准备测试的电极柄相连，当电极尖端同盐水膜接触时，表针指向低阻抗方向，当电极向前推进使尖端穿过盐水膜时，电阻陡然增至极大处，不良的绝缘或部分绝缘都会使表针向低阻抗端摆动;另一种测定电极绝缘的方法是把测试电极作为阴极置于盐液中电解，阳极可用废电池的炭棒也浸入盐水中，当直流电通过时，便可在测试电极的尖端或绝缘不良处产生出氢气泡，绝缘处不会有气泡产生。一支绝缘合格的电极便可用来定向地损毁某一神经核团。通常损毁中枢神经系统的某些结构要借助脑立体定位仪来作三维定位。电极被推进到预定的部位时，即可向电极通入一阴极电流，通过的电流量和通电时间的长短视预定损毁的范围而定，但通常电流量都在10mA以下。无关电极可接于皮肤创口处，而且其面积要远大于损毁电极，损毁电极通阴电是为了避免电极被电解。但在尖端易有氢气堆积而使电极阻抗变异较大。为了标定其损毁位置，常在电损毁之后把电流的极性倒转，使正电通过损毁电极，这样便有一些铁离子沉淀在组织中。随后动物经心脏，先用生理溶液灌流冲洗血液，再用含有1%亚铁氰化甲的福尔马林溶液灌流，电解部分便会产生膝氏蓝色斑点。应用直流电损毁是一种易于操作、可靠的方法，但要获得满意的结果，包括准确的损毁范围，需经过反复多次的摸索。实验后对脑组织切片作检查是验证损毁范围和准确性的最好手段。除应用单极损毁外，还可采用同心电极和集束电极法进行损毁，其原理都是相同的。 应用本方法的缺点是这种损毁无选择性，电极周围的胞体和经过的轴突，皆毫无例外地受到损伤。因此，讨论损毁后的结果时要特别小心。 二、神经毒物损毁 正如上述用电凝法对神经组织造成的损伤是非特异性的，因此难以分析实验的结果是由于核团或路过纤维受损伤所致。最近十几年来，应用某些神经毒物质，可以选择性地破坏某些特定功能神经元或核团，如6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine)便是这一类药物，它对儿茶酚胺类神经元有特异的亲和力而在神经元内堆积，从而破坏儿茶酚胺神经元的功能，而对其非单胺类神经元，如胆碱能神经元或GABA能神经元的功能没有影响。 目前一种最常用的非特异性神经毒化学物质是1978年由Coyle等发现的一种从海草中提取出来的，在结构上酷似谷氨酸的物质，即红藻氨酸或称为海人酸(kainicacid)。局部注射该物质，两天后先引起神经元广泛溃变，随后其末梢也溃变，但不影响通过注射部位的神经末梢或穿越的神经轴突。 注射后引起神经元结构病理改变的顺序可参阅文献1，与电凝法一样，动物在麻醉后固定于立体定位仪上，用直径约0.3mm的不锈钢导管插入预定脑区，然后把红藻氨酸按1分钟不大于1μl的速度均速推入脑区，其浓度为0.5～5mg/ml，稀释于0.14mol/L的NaCl液中，并用NaOH滴定到pH7.4，注射后的第48小时，注射区的神经元快速溃变，其特征是染色质溶解，核周体核染色质固缩，最终核膜崩解。在注射后的第一至第三周，被注射的灰质区内星状胶质细胞急剧增殖并占据原来神经元的位置，神经元及其突起都产生溃变。显微结构的研究证明，穿越注射区的轴突并不受到影响，因此，应用这一技术合适于选择性地破坏神经核团和追踪神经元之间的联系。 三、单个神经元的杀伤技术 利用低等动物，如海兔、水蛭神经节细胞作为神经生理学及药理学的研究日益受到重视。同样，利用组织培养观察不同类型神经元之间的联系也是目前神经生物学界日益采用的手段。因此，选择性地杀灭某一特定功能的神经元，并比较杀灭前后剩下的其他神经元的功能变异，是鉴定被杀灭神经元功能的最好办法。 已有资料证明，在低等动物中，当轴突脱离神经胞体