人SonicHedgehog基因远距离增强子ZRS调节基因表达机制的初步研究.docVIP

论文：人Sonic Hedgehog基因远距离增强子ZRS调节基因表达机制的初步研究 【中文摘要】Sonic Hedge基因在动物个体发育过程中起到形态发生素的作用,在多种器官和组织形成中发挥效用,如大脑,脊髓,丘脑,肢芽,上皮组织等,目前研究已经表明,在不同的组织中shh(Sonic Hedgehog)基因的表达是由不同的增强子序列调节起作用的。在肢芽中,shh的表达受到距离其上游1Mb远的一段保守序列ZRS (ZPA regulatory sequence)的调节,而当该序列内部出现点突变时,shh在肢芽部分的表达会发生变化,从而导致轴前多指畸形(PPD)这种严重遗传病的出现。ZRS序列本身非常保守,在人、小鼠、大鼠、鸡、河豚中,目前已经有报道10个以上的点突变会引发肢芽部分的发育异常。本实验从病人样本的基因组中筛选到了一个没有被报道过的点突变(3CG),PCR扩增了两种长度的含有点突变的DNA序列,并通过使用荧光素酶报告基因活性检测系统,在HEK-293A细胞中,发现具有点突变的ZRS序列和野生型的ZRS序列均具有增强子活性,而且活性是突变型的高于野生型的序列。对于这个突变体的生物信息学分析发现,该点突变可能会改变这段增强子序列的转录因子结合位点,因此使Shh基因的表达出现了异常。... 【英文摘要】Sonic Hedgehog works like a morphogen during the animal individual development. It functions in many organs, such as brain, spinal cord, thalamus, limb bud and epithelial cells. Recently reports show that in different tissues, different tissue specificity enhancers regulate shh expression. During limb bud shaping, the conserved ZRS sequence locating IMbp upstream of the shh proximal promoter regulates shh expression as a long-range enhancer. And point mutation in this ZRS sequence would cause the preaxial p... 【关键词】 【英文关键词】Sonic hedgehog ZRS DAPA Luciferase Reporter Assay System Point Mutation 【索购全文】联系Q1：138113721 Q2：139938848 【目录】人Sonic Hedgehog基因远距离增强子ZRS调节基因表达机制的初步研究 中文摘要 4-5 Abstract 5-6 缩略词 10-11 第1章 前言 11-16 1.1 Sonic Hedgehog基因简介 11-13 1.2 shh基因表达调控模式简介 13-15 1.3 本课题的实验目的、意义和研究策略 15-16 1.3.1 实验目的和意义 15 1.3.2 研究策略 15-16 第2章 实验材料和方法 16-29 2.1 实验材料 16-19 2.1.1 菌种和载体 16 2.1.2 人血液样本 16 2.1.3 细胞系和细胞培养基 16 2.1.4 工具酶,试剂(盒) 16-17 2.1.5 试剂的配制 17-19 2.2 实验仪器 19 2.3 实验方法 19-29 2.3.1 提取质粒DNA 20 2.3.2 切胶回收DNA 20-21 2.3.3 纯化PCR产物及酶切产物 21-22 2.3.4 提取血液中的基因组DNA 22-23 2.3.5 连接反应 23 2.3.6 质粒DNA及连接产物转化感受态细胞 23-24 2.3.7 菌落PCR鉴定阳性克隆 24 2.3.8 SDS电泳 24-25 2.3.9 细胞复苏 25-26 2.3.11 细胞冻存 26 2.3.12 细胞计数 26-27 2.3.13 HEK-293A细胞转染 27 2.3.14 双荧光素酶报告基因检测系统 27-29 第3章 ZRS点突变的筛选 29-36 3.1 从病人样本中调取ZRS序列并测序分析 29-32 3.1.1 实验材料 29 3.1.2 方法,结果及分析 29-32 3.1.2.1 从病人血液样本中抽提基因组DNA并进行定量 29 3.1.2.2 从提取的基因组中克隆带有ZRS序列的DNA片段 29-31 3.1.2.3 4个病患样本中有2个出现了点突变