基因芯片实验中的细胞和组织制备规程.docxVIP

一个完整的基因芯片实验包括以下几个步骤：研究课题的提出、芯片设计、样品制备、杂交反应、数据分析和处理。本文主要介绍其中的样品制备(细胞标本采集和组织标本采集)的建议做法 一个完整的基因芯片实验包括以下几个步骤：研究课题的提出、芯片设计、样品制备、杂交反应、数据分析和处理。本文主要介绍其中的样品制备(细胞标本采集和组织标本采集)的建议做法。 细胞标本采集操作建议规程 1. 所有样品均应有样品标签(注明样品编号)，同时有一张样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等。 2. 一张芯片实验一般要求细胞数在1E+08，建议设计实验和收获细胞时可考虑多收集一些。 3. 贴壁与悬浮细胞培养诱导结束后，去除培养液，保留的细胞用PBS缓冲液洗一下，除去缓冲液，加溶液D*充分溶解细胞，放入液氮运输。样品量以实际得到的total RNA为准。 4. 血液：将白细胞分离出来，加溶液D充分溶解细胞，放入液氮运输。样品量以实际得到的total RNA为准。 5. 如果是细胞未经溶液D处理，直接冻入液氮罐(不推荐)。工作人员会对细胞作相关处理，以便为细胞记数。 6. 以上提到的均是新鲜细胞，对一些已老化或质量不明的细胞，工作人员有权提出疑义，并要求退回或重新取样。 不同组织抽提3-10μg mRNA所需组织量 器官/组织*提取3μgmRNA所需组织量(克)提取10μgmRNA所需织量(克)总RNA得率[单位:毫克RNA/克组织]mRNA所占百分比[%]成人正常组织肝0.20830.69441.80 - 1.80 mg/g0.80成人正常组织脑缺数据缺数据1.30 - 1.30 mg/g缺数据成人正常组织肺0.30001.00001.00 - 1.00 mg/g1.00成人正常组织心0.50001.66670.60 - 0.60 mg/g1.00成人正常组织胃0.18520.61732.70 - 2.70 mg/g0.60成人正常组织喉0.31251.04171.20 - 1.20 mg/g0.80病理组织结肠癌0.25210.84031.70 - 1.70 mg/g0.70病理组织胃癌0.43171.43880.50 - 0.50 mg/g1.39病理组织空肠腺癌0.35711.19051.40 - 1.40 mg/g0.60病理组织直肠癌0.16040.53481.70 - 1.70 mg/g1.10病理组织肝癌0.11160.37203.84 - 3.84 mg/g0.70病理组织肺癌0.12820.42742.00 - 2.00 mg/g1.17考虑到个体差异以及样品在研磨、匀浆等过程中的损失，客户提供的样品量应在上述基础上增加1-2倍。 组织标本采集操作建议规程 铝箔经DEPC水浸泡过夜，78°C烘干，高压灭菌后烘干1.5 ml?微离心管15 ml?聚丙烯离心管市场有售RNAase-Free的相应规格离心管标签纸记号笔样品登记表由客户指定专人填写液氮罐应常备液氮罐，并保证液氮的来源取材部位的病理切片由客户提供1-2张注： · 以下步骤1 - 5应在冰上进行且不超过15分钟，超过时间会导致样品的RNA降解。 · 对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。 1. 离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜;肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净(正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净)。 2. 在RNase-Free 0.9%生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。 3. 用铝箔包裹组织，或用5ml冻存管装载组织(但最好统一采用铝箔)。用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。 4. 填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等 。 5. 将液氮冷却的组织放入样品袋(每个样品袋只保存同样的组织)，袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸(标签上注明：样品名称、编号、日期)，迅速转入便携式液氮罐。 6. 保留1-2张取材部位的病理切片。 基因芯片样品的制备要点： 1.目的DNA的选择对于大规模地研究基因表达问题，需要分析每一个基因的表达。因此，选择的目的DNA必须能够代表要研究的各个基因。对 于整个基因组序列全部已知的生物，最直接的方法是用PCR扩增基因组中每个已知的或预测的开放阅读框架(openread