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实验四 重组质粒的抽提 实验目的 了解基因工程操作中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。 实验原理 碱变性抽提质粒DNA是根据质粒DNA与染色体DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱（NaOH）及表面活性剂（SDS）使细胞破壁、膜，释放出胞内染色体DNA、质粒DNA及其它物质。通过一系列的纯化过程：高盐除去核DNA，苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类，然后用乙醇（或异丙醇）沉淀出质粒DNA和RNA等，RNA经RNase消化，得到质粒DNA。这种质粒DNA可用作基因工程的载体，更广泛地用于重组子的鉴定。 实验材料 E.coli 实验仪器、器皿及试剂 仪器、器皿（略） 试剂： 1、溶液1：50mmol/l 葡萄糖 10mmol/l EDTA-Na2 25mmol/l Tris-HCl（pH8.0） 4mmol/l 溶菌酶 2、溶液2：200mmol/l NaOH 1% SDS 3、溶液3：5mol/lKAc 60ml 冰乙酸 11.5ml ddH2O 28.5ml 4、苯酚-氯仿 5、异丙醇（或95%乙醇，100%乙醇） 6、70%乙醇 7、TE（pH8.0）：10mmol/l Tris-HCl（pH8.0） 1mM EDTA-Na2 8、RNase 1mg/ml Amp 100μg/ml 实验步骤 1．挑取一单菌落的E.coli菌种接种到含Amp100μg/ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。 2．吸1.4ml菌液至Eppendorf管中，在高速台式离心机上5000g离心2min，倒去培养基。 3．重复1次，尽可能倒出培养基并将Eppendorf管倒置于吸水纸上，以吸干管壁上残留的培养基，收集细菌。 4．将细菌悬于500μl冰冷的溶液1中，于离心机上5000g离心2min。 5．倒去溶液1，再悬于200μl冰冷的溶液1中，重悬菌液。 6．加入300μl新配制的溶液2，冰浴5min。 7．加入300μl冰冷的溶液3，中和，轻轻震荡10sec，置冰浴5min。 8．于离心机上，12000g离心5min。 9．取600μl上清转移至一新管中。 10．加入等体积的饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提1次，10000g离心5min取上清液，转移至一新管。 11．加入1/10体积NaAc溶液（3mol/l），再加入2倍体积的无水乙醇 ，－20℃沉淀20min。 12．10000g离心10min。 13．倒去无水乙醇，用1ml 70%乙醇洗涤沉淀，10000g离心5min。 14．置冰箱内开盖干燥。悬浮至40μl去离子水或TE中。 六、注意事项 1．所用器具必须严格清洗，最后要用重蒸水冲洗3次，凡可以进行灭菌的试剂与器具都要经过高压蒸汽灭菌，防止其他杂质或酶对 DNA的降解，对 Eppendorf管、Tip与非玻璃离心管等只能湿热消毒，这些塑料制品烤干时，温度不能超过80℃，以免熔化，因此，一般用70℃烘烤。 2．细菌培养容器最好用三角烧瓶，其容量至少应为培养液的四倍，从而保证氧气的供应。 3．在碱裂解提取质粒的方法中，关键步骤之一是加入NaAc的时机，这一步决定了DNA变性与复性的时间。既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不裂解成小片段，才能与质粒DNA相分离，这就要求试剂与溶液充分摇匀。 4．加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖颠倒摇动4-5次，使水相与乙醇混匀。 5．乙醇沉淀后，乙醇应尽量去除干净，否则既不利于DNA的溶解，又对后面的操作有影响。 思考题 1．有机溶剂抽提为什么可以达到除蛋白、脂类杂质的目的？ 2．异丙醇沉淀DNA后为什么要经过70%乙醇清洗这一步？ 3．逐步说明强碱法提取质粒DNA的原理。