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已冻存细胞的传代培养实验试剂细胞培养液成分为RPMI1640基本培养液 10%胎牛血清 1%三抗，PBS，冻存培养液(含10%DMSO或甘油)，Trypsine-EDTA消化液，液氮实验设备水浴锅，35mm培养皿，37℃培养箱，无菌冻存管，低温冰箱，超低温冰箱实验材料已冻存的HEK293和HeLa细胞实验步骤1. 细胞的复苏??? 1) 保存细胞的冷冻管直接投入37℃温水，不时摇动令其尽快融化，解冻1分钟；??? 2) 取出冷冻管，用酒精消毒后打开管盖，吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，再用培养液重复洗一次；??? 3) 用培养液适当稀释后，接种35mm培养皿中，反复吹打混匀后，放在37℃的培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。2. 细胞的传代(贴壁细胞的消化法)??? 1) 吸出皿内旧的培养基，加PBS于皿中，清洗两次，用于洗去瓶内残存的血清，以防止血清对胰蛋白酶活性的影响；??? 2) 加0.2ml Trypsine-EDTA消化液轻轻摇动，使消化液流遍所有细胞表面充分消化细胞，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，立刻终止消化；??? 3) 吸出消化液，再加培养液，反复吹打至没有细胞团。吹打动作要轻柔，尽可能不要出现泡沫，这些都会对细胞有损伤。将细胞悬液接种到新的培养皿中。3. 细胞的冻存??? 1) 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，最好是对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。冻存前一天换一次培养液；??? 2) 用Trypsin-EDTA把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数离心；??? 3) 去除Trypsin-EDTA，加入配制好的冻存培养液(含10%DMSO或甘油)，冻存液中细胞的最终密度为106/ml-107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管，每个冻存管加液1-1.5ml。冻存管上标明细胞的名称；4) 把冻存管放入4℃冰箱30min；然后转移至-20℃2h；随后将冻存管转移到-80℃过夜；第二天迅速浸入液氮中长期保存。要适当掌握降温速度，过快会影响细胞内水分的渗出，太慢则促进冰晶的形成。传代细胞培养与观察实验原理传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的 水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。实验试剂L磷酸盐缓冲液(PBS)无钙、镁溶液细胞消化液：0.5％胰蛋白酶和0.4%EDTAEMEM液3%谷氨酰胺0.5％台盘蓝染液等实验设备解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。实验材料喉癌细胞实验步骤在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。1. 营养液配制:EMEM液??????????????????????????????? 90%犊牛血清?? ???????????????????????????? 10%双抗(1万单位／m1)??????????????? 加至约100单位／m1 3％谷氛酞胺?????????????????????????? 1m17.4％NaHCO3???????????????????????? 调pH至6.8—7.0 2. 换液:在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液。3. 消化与分装在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，轻轻摇动，将溶液倒出。重复上述动作。加入适量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml加 0.5％胰蛋白酶液0.2ml）以盖满细胞为宜，置于室温，停留1—2min后，翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙)，如出现缝 隙，即可倒去消化液；如末出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直到出现缝隙为让。此时，可倒去消化液，加入新配制的营养液20m1。然后用吸管吸取培 养瓶中的营养液，反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为