常用的几种精子制备方法.docVIP

常用的几种精子制备方法 手淫法将精液射于无菌杯中，放置于25～35℃，待其自然液化后进行常规检查，包括精液量、液化时间、精子计数、活动力、活动率、畸形率、红细胞、白细胞及凝集情况等。如果30分钟后精液仍不液化，可用吸管反复吹打，利用机械性外力使其液化。液化后精液进行处理，最常用的方法是上游法和Percoll密度梯度离心法。 (一)上游法 活动精子具有游过液体界面进入不同培养液的能力，利用精子这一特性使活力强的精子与死精子、凝集精子、畸形精子、白细胞及杂质分离，这种方法不影响精子的生物学特性。上游法能显著提高精子的活动率、正常形态百分率，增加具有正常浆膜的精子数，且显著提高精子的运动速度。上游法适用于精液液化不良及轻度少精、弱精患者。 1.标准上游法： (1)取试管数支，每管加入2.0ml培养液。 (2)再分别将0.5ml液化精液慢慢加入试管底部，使其形成两个界面。 (3)加盖，45°角倾斜，置于37℃、5%CO2孵箱中培养30～60分钟。 (4)收集各管上清液，200g离心5分钟，弃上清液，加2ml培养液，混匀后200g离心5分钟。 (5)留沉淀物，加0.5ml培养液制成精子悬液，调整精子密度为(10～30)×106/ml备用。 2.洗涤+上游法： (1)液化精液1∶3加入培养液，300g离心10分钟。 (2)弃上清液，沉淀中加入2～3ml培养液，轻轻混匀，再200g离心10分钟，弃上清液。 (3)另取一只小试管，加入0.5～1ml培养液，用吸管吸取经洗涤后的精子，缓缓加入试管底部，45°角倾斜，放入CO2培养箱内培养30～60分钟。 (4)收集上游精子，调整精子密度(10～30)×106/ml备用。 3.二次上游法： (1)取试管数支，每管加入2.0ml培养液。 (2)再分别将0.5ml已液化的精液缓慢地加入试管底部，使其形成两个界面。加盖，45°角倾斜，置于37℃、5%CO2孵箱中培养30～60分钟，收集各管上清液，200g离心5分钟，弃上清液，加2ml培养液，混匀后200g离心5分钟。 (3)留沉淀物，将沉淀轻弹至松散，在其上方轻轻加入适量培养液，放入孵箱中再次上游，受精时取中层精子悬液使用，精子密度为10×106/ml左右。 (二)下游法 采用下游法时精子不需要克服重力向上游动，所以回收率较上游法高。将0.5ml的血清放置在5mlFalcon试管底部，取0.1ml洗涤后的精子放在血清上方，形成界面，37℃孵育5分钟，然后吸取包含活动精子的大部分血清。因为没有离心，所以避免了精子的物理损伤或过度氧化的损害。 (三)Percoll密度梯度离心法 Percoll是一种用聚乙烯吡咯酮包被胶体硅形成的介质，具有分离活动精子的作用。Percoll梯度离心技术是目前国外研究较多、使用广泛、效果比较理想的方法之一。 1.连续一步Percoll梯度法：用于正常精子样品的处理，步骤如下： (1)新鲜配制等渗Percoll液(即90%Percoll)，溶液保持在2～8℃，使用前将温度升高到37℃。 (2)在15ml的锥形离心管中加入1.0ml的90%Percoll液。 (3)将1.5ml的精液缓慢加在Percoll液上面，两者留有清晰界面。如果精液量大于2ml，使用多个Percoll离心管。 (4)500g离心20分钟。如果样本比较黏稠，或精子密度较低，可以多离心10分钟。 (5)用吸管将Percoll和精液移开，注意不要碰到精子沉淀，在离心管中留0.4ml的Percoll液，这样能够收集到聚集在Percoll中的精子。 (6)用吸管加入3～5ml的精子培养液，混匀。 (7)500g离心5分钟，洗掉剩余的Percoll液。 (8)仔细地移去上清液，如果用于宫腔内人工授精(IUI)，则将精子沉淀悬浮于0.4ml培养液中；如果用于IVF，则用受精培养液调整好精子浓度。 2.微型Percoll梯度法：用于严重少弱精患者的精液，通常活精子总数少于5×106/ml。 (1)新鲜配制等渗Percoll液(即90%percoll)。 (2)向90%的等渗Percoll中加入精子培养液，配成表7-1的浓度。 表7-1Percoll液的配制 Percoll液密度梯度成分45%63%85.5%90%等渗Percoll液2.0ml2.8ml3.8ml精子培养液2.0ml1.2ml0.2ml 以上溶液在2～8℃保存最多1个月，使用前在培养箱内平衡温度至37℃。 (