第16章细胞因子及其受体检测免疫学.pptVIP

INTRODUCTION What are cytokines? Kinds of cytokines Cytokine -mediated effects Cytokine receptor families Why do we detect cytokines? Methods for cytokines analysis Kinds of Cytokines (structure and function) Interleukins (IL-1….35) Colony stimulating factors (M-CSF、G-CSF) Interferons (a, b, g) Tumor necrosis factors Chemokines (IL-8、GROs、MCP-1) Growth factors (EGF、FGF、IGF、PDGF) Cytokine –function (signal transfer) Cell growth Cell differentiation Cell death Induce non-responsiveness to other cytokines/cells Induce responsiveness to other cytokines/cells Induce secretion of other cytokines Why do we detect cytokines? Diagnosis or assistant diagnosis Monitoring immune function Cytokine therapy monitoring Study mechanisms of disease Methods for cytokines analysis Biological method Immunological mehtod Molecular method 第一节 生物学检测法 将细胞因子与指示系统如（细胞）相互作用，指示细胞发生增殖、死亡或分泌蛋白等变化来显示细胞因子的功能。 一、细胞增殖法 （一）原理 细胞因子可促进相应指示细胞分裂、增殖，如IL-2。 将不同浓度的细胞因子与指示细胞共同孵育一定时间，检测细胞的增殖情况，以确定细胞因子的量。 1．3H-TdR掺入法 2．?MTT比色法 3. CFSE 二、靶细胞杀伤或抑制法 （一）原理 主要用于肿瘤坏死因子（TNF）的测定 TNF具有杀伤肿瘤细胞的作用； 选择对TNF敏感的细胞系作为靶细胞； 与标准品进行比较。 （二）TNF敏感细胞株 小鼠成纤维细胞株L929和WEHI 164.13 三、细胞病变抑制法 （一）原理 主要用于检测干扰素 干扰素(IFN)可诱导细胞产生抗病毒蛋白，保护细胞不受病毒感染，抑制细胞病变。 将指示细胞、病毒和IFN标准品或待测样品置同一反应体系中，进行培养。病变程度与IFN活性成反比关系。 （三）技术要点 细胞的复苏和VSV的准备 细胞培养（细胞对照、病毒对照） 细胞病变程度的观察 IFN活性的计算 四、趋化活性测定法 用于趋化性细胞因子的测定 常用Boyden 小室法 五、生物学检测法的评价 （一） 优点 1．检测细胞因子的生物学活性。 2．灵敏度较高。 （二）缺点 1. 特异性不强。 2. 操作繁琐，实验周期长。 3. 影响因素较多，重复性较差，特别是批间差异大。 第二节 免疫学检测法 一、体液中细胞因子检测 双抗体夹心ELISA 放射免疫分析法 抗体芯片 酶联免疫斑点实验(ELISPOT) 二、细胞内细胞因子的检测 三、免疫学检测法的评价 免疫学检测法的评价 （一）优点 1．? 特异性高。 2．? 操作方法简便，时间短。 3．? 重复性好。 （二）缺点 1．检测细胞因子的蛋白含量。 2．敏感度不如生物学测定法。 第三节 分子生物学检测 一、DNA水平的检测 （一）Southern印迹杂交：不常用、DNA/DNA （二）PCR和原位PCR （三）荧光定量PCR （四）DNA序列测定 二、mRNA表达水平的测定 1、Northern blot 2、原位杂交 3、Real time-PCR 三、分子生物学检测方法的评价 敏感性高 可分析基因的多态性 需要一定的实验室条件 Cytokine receptor families Immunoglobulin superfamily receptors Class I cytokine receptor family (hematopoietin receptors) Binds most of the cytokines in the immune and hematopoietin systems Class