赖氏法-ALT.pdf

赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶 【原理】 L-丙氨酸 + α-酮戊二酸 ALT α-丙酮酸 + L-谷氨酸 α-丙酮酸 + 2 ，4-二硝基苯肼 ALT 2 ，4-二硝基苯腙 （红棕色，λ=505nm ） 利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中丙 氨酸氨基转移酶（ALT ）活性。 【试剂】 1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液 称取KH PO 13.61g，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml， 2 4 4 ℃保存。 2 ．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取Na HPO 14.22g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml， 2 4 4 ℃保存。 3 ．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4 ） 取420ml 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液，混匀，即为pH7.4 的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4 ℃保存。 4 ．基质缓冲液 精确称取D-L-丙氨酸1.79g，α-酮戊二酸29.2mg ，先溶于0.1mol/L 磷 酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4～6℃ 保存，该溶液可稳定2w 。每升底物缓冲液中可加入麝香草酚0.9g 或加氯仿防腐，4 ℃保存。 配成200mmol/L 丙氨酸与2.0mmol/Lα-酮戊二酸基质缓冲液。 5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液 称取2，4-二硝基苯肼（AR ）19.8mg，溶于1.0mol/L 盐酸 100ml，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若冰箱保存可稳定2 个月。若有结晶析出， 应重新配制。 6 ．0.4mol/L NaOH 溶液 称取NaOH 1.6g 溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至100ml，置 具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。 7 ．2.0mmol/L 丙酮酸标准液 准确称取丙酮酸钠（AR ）22.0mg ，置于100ml 容量瓶中， 加0.05mol/L 硫酸至刻度。此液不稳定，应临用前配制。丙酮酸不稳定，开封后易变质（聚 合），相互聚合为多聚丙酮酸，需干燥后使用。 8．待测标本 病人血清或质控血清。 【操作步骤】 1．ALT 校正曲线绘制： （1）按表19-1 向各管加入相应试剂。 表 19-1 ALT 各标准管的配制方法 加入物（ml ） 1 2 3 4 5 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 2.0mmol/L 丙酮酸标准液 0 0.05 0.10 0.15 0.20 基质缓冲液 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 2,4-二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，37℃水浴20min 0.4mol/L NaOH 溶液 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 相当于酶活性浓度（卡门氏单位） 0 28 57 97 150 （2 ）混匀，放置5min，在波长505nm 处，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，各管吸光 度均减“1”号管吸光度为该标准管的吸光度值。 （3 ）以吸光度值为纵坐标，对应的酶卡门氏活性单位为横坐标，各标准管代表的活性 单位