端粒相关蛋白在某些重大疾病中的调节机制.doc

端粒相关蛋白在某些重大疾病中的调节机制 揭示宫颈癌中端粒酶的调控机制，尤其是端粒相关蛋白磷酸化及其在基因转录水平上的调控，提出抑制肿瘤细胞永生化的新策略。研究端粒相关蛋白在特异性肺纤维化的作用。 研究 （1）端粒相关蛋白质磷酸化与去磷酸化在宫颈癌细胞中的调控机制:前期研究表明，端粒酶磷酸化后，将会提高端粒酶活性；反之蛋白磷酸酶2A去磷酸化，抑制端粒酶活性。通过点突变筛选22个潜在的TERT磷酸化位点，我们发现两个可能性高的磷酸化位点，分别位于TERT蛋白C末端和中心序列的丝氨酸残基。我们将以宫颈癌细胞为模型，研究TERT磷酸化的机制，确定参与TERT磷酸化的蛋白激酶及其信号通路。待检查的蛋白激酶包括ATR, ATM和DNA依赖性蛋白激酶。我们将研究磷酸化和去磷酸化的TERT与hTERC与端粒DNA以及与其它端粒相关蛋白复合体的相互作用。研究POT1磷酸化对其调控的机制，尤其是与端粒酶及端粒DNA相互作用和转换机制。我们推测，在POT1/TPP1招募TERT与端粒DNA结合、在端粒DNA与不同的端粒蛋白复合体切换过程中，蛋白质磷酸化/去磷酸化是一个重要的开关式调节机制。我们将应用重组的蛋白质研究磷酸化对蛋白之间、蛋白和端粒DNA之间的相互作用。在临床宫颈癌标本和培养的细胞内，在鉴定基因表达后，通过免疫沉淀、质谱分析及磷酸化标记等方法，确定端粒相关蛋白的磷酸化调控机制。用不同突变体和抑制剂及免疫去除等方法作特异性对照，鉴定端粒相关蛋白磷酸化对端粒长度的影响和对细胞分裂的作用。 （2）表观遗传学及FOX基因转录抑制因子在宫颈癌细胞中对TERT基因转录调控机制:在端粒酶调控的机制中，激活TERT基因转录是关键的一个环节，TERT基因转录主要调节因子包括c-myc, Sp1和Ets2。本研究将实时测定宫颈癌细胞中TERT表达、TERT启动子转录活性和TERT全长启动子DNA甲基化。应用ChIP及Re-ChIP技术系统分析不同细胞周期TERT全长启动子（9kb）与各种不同转录因子的结合，绘制TERT全长启动子DNA甲基化、DNA甲基转移酶、各种组蛋白修饰酶的募集和组蛋白H3（H3-K9、K14）、H4（H4-K5、12、16）乙酰化，甲基化（H3-K4、K9，K27、K36，H4-K20）状态的图谱。确定特异转录因子与不同组蛋白修饰酶募集的相关关系，最终阐明肿瘤细胞在不同信号通路整合后的TERT基因调控网络。我们将研究TGF?下游FOX蛋白对TERT基因的调节作用，包括与其它基因转录因子（如c-myc和Ets2）以及对癌细胞增殖的调节作用。FOX蛋白特征是有一个叉头的结构域，由80到100个氨基酸残基形成，能与富含腺嘌呤DNA序列结合。我们将筛选FOX蛋白中不同的亚型（FOXA到FOXS），包括Akt/PTEN，研究磷酸化调控的FOX对TERT基因启动子活性的调控及机制。我们推测，通过调节TERT基因表观遗传学特征和FOX转录抑制因子，有可能控制宫颈癌细胞端粒酶活性和永生化。 （3）TGF?受体对端粒酶TERT基因调节的机制: 前期研究显示，TGF?RII受体介导BMP对端粒长度的正负调控作用。我们将研究具有不同特异性的RI受体（ALK1, ALK2, ALK3和ALK6）传递来自RII受体的信号，产生对TERT基因的调节和不同的端粒重塑效果。为鉴定出相应的RI受体，采用突变、显性正相和负相基因表达方法，检测端粒酶活性和端粒长度。包括分别对ALK3的Q239和W271实施突变，使ALK3失活，从而完全阻断ALK3信号通路；而在甘氨酸-丝氨酸丰富的激活区（GS区域，RI受体激酶区之前的30个氨基酸）实施R206H(或者617G→A)突变，可激活ALK2。在不同的细胞因子刺激的宫颈癌细胞中，研究RI受体的过表达和低表达对Smad1/5/8和Smad2/3磷酸化的影响。测定端粒酶活性和端粒长度、确定癌细胞增殖、衰老和凋亡。这些研究将揭示TGF?RI受体是如何介导调节宫颈癌细胞中端粒酶活性和端粒的长度。 （4）端粒酶对恶性肿瘤转移的调节作用:前期工作表明，端粒酶的表达增加肿瘤细胞转移过程中的上皮细胞向间充质细胞的转变(EMT)。而抑制端粒酶将导致EMT降低，有可能通过调节EMT影响癌细胞的转移。为了探讨TERT是否促进正常上皮细胞EMT和去分化，从外科切除的胃肠组织标本中获取正常胃、肠上皮细胞，改变TERT在这些细胞中的表达，观察细胞在形态学、EMT、干细胞标志及细胞功能方面的变化。比较不同TERT表达水平细胞的基因及miRNA表达变化,以期发现下游的效应分子或特异miRNAs。同时寻找与TERT相互作用，介导EMT的中间分子，TERT与EMT调节通路相关因子的可能作用也一并加以分析。另外，TERT的这一作用是否依赖于端粒延长功能也将通过表达变异