端粒相关蛋白在细胞衰老中的作用机制.doc

端粒相关蛋白在细胞衰老中的作用机制 阐明端粒相关蛋白在细胞衰老中的作用，筛选出2-6个参与调节细胞衰老的关键“节点”基因。明确端粒结合蛋白例如hnRNP A1等3-4个端粒相关蛋白在细胞衰老信号网络中的作用。揭示这些端粒相关蛋白在细胞衰老中的作用机制。 研究 （1）端粒结合蛋白hnRNP A1与细胞衰老中的作用:研究发现端粒相关蛋白hnRNP A1可破坏端粒DNA的高级结构G-四联体，调节端粒酶的活性，而且在体内端粒末端也检测到hnRNP A1的存在。第一课题组最近的研究也发现hnRNP A1蛋白和非编码RNA TERRA调节RPA和POT1在端粒单链DNA上的转换，从而调节端粒长度及功能。因此，hnRNP A1在端粒调控中非常重要,可能与复制性衰老及肿瘤的发生、发展密切相关。hnRNP A1的启动子区含有很多E-box，癌基因E2F AP1, AML和c-myc可以与之结合，而且这些癌基因在正常细胞里可条件性表达。所以，正常细胞的hnRNP A1表达在某些条件下可被癌基因调控，向衰老或永生化方向发展。①研究hnRNP A1蛋白差异表达机制，阐明hnRNP A1蛋白在衰老过程中差异表达与细胞衰老主导基因的关系及其hnRNP A1蛋白核浆穿梭的意义及其对端粒长度的影响。进一步研究hnRNP A1蛋白翻译后修饰及其对端粒G-四联体形成的影响,以及对端粒长度调节和相关疾病的诊断具有重要意义。②研究hnRNP A1 RNA降解机制在细胞衰老中的作用。研究发现RNA结合蛋白hnRNP A1可影响p16基因mRNA的稳定性,并且hnRNP A1表达减少伴随p16蛋白水平的显著增加。我们拟深入研究hnRNP A1对细胞衰老与细胞寿命的调节机制，了解hnRNP A1上游调节分子和其他靶标mRNA，以及其它分子对此种调节作用的影响。③研究hnRNP A1的转录调控。hnRNP A1高表达，既可延缓细胞衰老，又有促癌作用，其表达调控机制复杂多变。研究如何保持其促癌作用与延缓衰老作用之间的平衡是一重要问题。环境与基因表达之间常常存在互动关系，我们将研究hnRNP A1的表达调控是否受环境变化调控。 （2）端粒酶TERT结合蛋白在细胞衰老中的作用:前期工作利用酵母双杂交方法发现了多个新的TERT结合蛋白， 并用GST沉淀和免疫共沉淀等方法得到验证。我们将进一步研究TERT结合蛋白的相互作用如何调节端粒酶功能，以及对细胞周期、DNA损伤反应和细胞衰老的作用机制。①结合基因过表达和基因沉默研究TERT与其相关蛋白的相互作用对细胞周期的调节作用。将利用 DNA损伤药物（HU, nocodazole, etoposide, cisplatin）诱导DNA损伤，分析TERT结合蛋白之间的相互作用对DNA损伤修复、细胞周期检验点的调节作用。②基因沉默或过表达改变TERT结合蛋白和TERT表达水平后，通过检测细胞增殖、细胞迁移、细胞集落形成等实验探讨TERT与TERT结合蛋白相互作用的细胞生物学意义。③我们前期工作发现TERT结合蛋白例如C53在细胞复制性衰老中表达显著升高。过表达或基因沉默TERT结合蛋白基因后，观察细胞衰老进程，检测衰老基因表达(p53, p21, Rb, p16)变化及端粒DNA损伤信号，明确TERT结合蛋白对细胞复制性和过早性衰老的作用和机制。 （3）TERT结合蛋白与成体干细胞衰老的关系：基于以上在体细胞研究中的前期工作基础，进一步利用小鼠模型，在成体干细胞水平研究TERT结合蛋白与端粒维持及细胞衰老的关系。①在野生型小鼠和端粒酶敲除小鼠中，观察成体干细胞（如骨髓造血干细胞）衰老过程中TERT结合蛋白的表达变化，及其对端粒长度和端粒酶活性的影响。②分离和培养野生型小鼠和端粒酶敲除小鼠的骨髓造血干细胞，在体外用过表达或基因沉默技术改变TERT结合蛋白的表达水平，分析TERT结合蛋白的改变对成体干细胞增殖以及克隆形成能力的影响。③利用造血干细胞移植实验，探索TERT结合蛋白对年轻和年老的小鼠造血干细胞自我更新能力和多系分化能力的影响。通过移植TERT结合蛋白表达水平改变的成体干细胞到致死剂量照射的小鼠体内，分析造血干细胞在体内的自我更新能力以及多系分化能力，并验证TERT结合蛋白在骨髓造血干细胞增殖和分化过程中端粒维持中的作用。 （4）端粒相关蛋白TPP1、POT1a、POT1b在成体干细胞稳态维持和衰老中的作用: POT1（在小鼠中分为POT1a和POT1b）与端粒上的单链DNA结合，起着保护端粒的作用。POT1a防止ATR激酶的激活，从而抑制了端粒上的非同源末端连接(NHEJ)，而POT1b抑制5’端粒DNA的切除。两种POT1蛋白都可以与TPP1结合，形成异源二聚体与其他的端粒蛋白相结合。条件敲除TPP1后，导致POT1a和POT1b