细胞的原代培养和传代培养.docVIP

实验五 细胞的原代培养和传代培养 1. 实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。 2. 实验指导 细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。 细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。 要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。 贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。 常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。二者可分别使用，也可共同使用。钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。 细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。 原代培养和传代培养的细胞依据其生长状态，可分为贴壁生长细胞与非贴壁生长细胞。 一般说来，来自外周血的细胞，如红细胞、白细胞、白血病细胞等都是非贴壁细胞；而来自其他组织的细胞则多为贴壁细胞。 贴壁细胞依照其镜下特征，可分为以下4种类型。 ① 成纤维型细胞。 ②上皮型细胞。 ③游走型细胞。 ④多形型细胞。 本次实验中原代培养的为兔肾成纤维细胞，生长状态良好时为标准的成纤维型细胞。传代培养的HeLa细胞为黑人宫颈癌细胞，为标准的上皮型细胞。 3.实验材料 3.1器材:手术器械一套，直径9cm培养皿一套，培养瓶4个，吸管3支，离心管2个(以上用品为每只乳兔所用)，C02培养箱，超净工作台，酒精灯，倒置显微镜，HeLa细胞。 3.2试剂：0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA混合消化液，RPMI-1640培养液 (含5%小牛血清)，0.01%PBS，75%乙醇。 3.3动物：乳兔 4.实验方法 4.1细胞的原代培养 4.1.1方法 ① 取材: 用颈椎脱位法处死乳兔，然后把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中，数秒消毒后取出(注意：浸泡时间过长，乙醇从口和肛门侵入体内会影响组织生长)，携入超净台，放在大平皿中。分别用碘酒和乙醇进行一次背部消毒，再用消毒过的剪刀剪开乳兔背部的皮肤和肌肉，取出肾脏，置于另一个无菌培养皿中。 ②切割: 用灭菌的PBS液将取出的肾脏清洗3次，然后用眼科剪刀和镊子仔细将肾脏外包膜除去，之后将组织反复剪碎，直至剪成0.5～1mm3左右的小块。再用PBS液清洗，直至组织块发白为止。然后移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到离心管的管底，弃去上清液。 ② 消化分离: 吸取0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，加上胶塞，在37℃水浴箱中消化8～10分钟，每隔几分钟轻轻摇动一下离心管，使组织与消化液充分接触。消化结束后静置3分钟，吸去上清。 ④接种培养：向离心管中加入5～10ml含5%小牛血清的1640培养液，用吸管吹打混匀，移入2个培养瓶中。盖好瓶塞，做好标记，置于C02培养箱中37℃培养。 4.1.2结果观察 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5～7天即可形成单层。 4.2细胞的传代培养 4.2.1方法 ① 将长成单层的细胞从CO2培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少量消化液 (以液面覆盖住细胞即可)，之后立即弃掉消化液。 ②静置3～5分钟，加入3～5ml新鲜培养液(在酒精灯上进行操作)，吹打，制成细胞悬液。 ③将细胞悬液吸出2ml左石，加入另一无菌培养瓶中(在酒精灯上进行操作)，并向每个培养瓶中分别加入3ml左右培养液，盖好瓶塞，做好标记，送回二氧化碳培养箱中，37℃继续进行培养。 4.2.2结果观