RNA提取标准操作规程.docVIP

研究机构名称：中国药科大学药代动力学重点实验室 SOP编号： SOP名称：RNA提取标准操作规程 1. 目的 本SOP的目的是为了保证RNA提取实验的标准化和可重复性。 前言 本SOP涉及细胞及组织样品的RNA提取的标准化操作过程。 范围 本SOP适用于中国药科大学药代动力学重点实验室的全体实验操作人员。 职责 4.1 细胞室PI应指派专人负责RNA提取实验前的培训。 4.2所有实验操作者应经由专人培训，明确RNA提取实验的原理及步骤后方可独立操作。 操作步骤 5.1 实验前准备 RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶污染。 5.1.1 器具准备 RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 （1） 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。 （2） 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。 5.1.2 试剂配制： （1）RNAiso Plus 试剂购于货号：样品量 RNAiso Plus使用量（ml） 10 cm2的贴壁培养细胞 107的悬浮培养细胞 1～2 100 μl的白细胞 2 100 μl全血2 50～100 mg的普通组织样品 50～100 mg的特殊组织样品（肝、脾、骨及软骨等） 15～30 mg的植物材料（多糖和多酚含量不高的） 组织30mg，细胞1×107 ↓ 加1ml RNAiso Plus ↓ 组织：要彻底，转至EP管 细胞：用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓颠倒混匀10下，室温5分钟↓ 加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5） ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟（剧烈振摇） ↓ 4℃，离心12000g，15分钟 ↓ 转上层水相（约500μl）于另一1.5mlEP管中 ↓ 加等体积异丙醇（约500μl），颠倒混匀室温10分钟 ↓ 4℃，离心12000g，10分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml ↓ 4℃离心00g，5分钟 ↓ 弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥） ↓ 溶于DEPC水中至10 μl（可在55-60℃水中，10分钟助溶） μg/μL。 （3）RNA提取量较低怎么办？ ① 向组织材料中加入RNAiso Plus后，请充分研磨匀浆使其充分裂解。 ② 相分离后请尽量完全回收上清液。 （4）提取的RNA不溶怎么办？ ① 75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。 ② 可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时。 ③ RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清液时，避免枪头接触蛋白层。 ④ 溶解液更换为0.5%的SDS溶液（DEPC处理水配制）。 （5）OD260/OD280值1.65，为什么？ ① RNA应使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强度或低pH值会使OD280值升高。 ② 样品裂解时加入的RNAiso Plus量偏少，造成蛋白变性不充分，可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。 ③ 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟。 ④ 相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。 ⑤ RNA未充分溶解。 （6）提取的RNA降解，为什么？ ① 使用的组织材料不够新鲜。提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。 ② 提取RNA时使用的试剂及器材中混有RNA分解酶。 ③ 提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶，而RNAiso Plus的添加量不够。 （7）提取的RNA中含有DNA污染，为什么？ ① 裂解组织或细胞使用的RNAiso Plus量偏少。 ② 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等）、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。 ③ 如果提取的RNA中含有DNA时，可以使用DNase I进行DNA消化。