微生物综合实验设计方案（生技121第八组）.docVIP

土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定 生技121班 吴金明 闫瑞强 邝毅璋 李北娇 邓其芬 关键词：淀粉酶 芽孢杆菌 淀粉酶活力 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各, 可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌、凝结芽孢。由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体表面及水体中所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 ①掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法； ②学会微生物分离纯化原理及方法和技术； ③学会掌握产淀粉酶活力测定的原理和方法。 ④培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。为了获得某种微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同,而供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而淘汰其他一些不需要的微生物,再用稀释涂布平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物,直到得到纯菌株。在自然界的土壤中有可能分布着能产淀粉酶的芽孢杆菌，通过土样稀释、加热土壤悬液杀非芽孢细菌、平板分离可获得细菌的单菌落，经革兰氏染色、芽孢染色可判断分离菌株是否为芽孢杆菌，将单菌落点接含有淀粉的平板，凡是具有产淀粉酶能力的的芽孢杆菌能水解淀粉，从而在淀粉平板上菌落周围会出现水解圈，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。由此可将产淀粉酶能力的菌株分离，分离后再进一步划线纯化，对分离出的各菌株可通过形态观察及染色，得到纯培养的芽孢杆菌。 根据从伯杰式细菌学手册芽孢杆菌属中检索到的芽孢杆菌的生理生化特点，选取能从土壤中分离到的芽孢杆菌种为标准菌种，通过对目的菌种进行多项生理生化实验，对比伯杰式手册的实验结果，从而鉴定出目的菌的种别。 芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25到75以上；最低生长温度大约5到45；生长最低pH值，从7.5—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源 蛋白胨牛肉膏氯化钠琼脂～2蒸馏水将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内加入15%氢氧化钠溶液约2mL校正pH至7.2～7.4。加入琼脂,加热煮沸使琼脂溶化。7H2O 0.04g，KHPO4·3H2O 0.2g，(NH4)2HPO4 0.2g 耐盐培养基：蛋白胨牛肉膏 氯化钠琼脂～2 蒸馏水蛋白胨牛肉膏 氯化钠琼脂～2 蒸馏水蛋白胨牛肉膏 氯化钠琼脂～2 蒸馏水蛋白胨牛肉膏 氯化钠琼脂～2 蒸馏水蛋白胨牛肉膏 氯化钠琼脂～2 蒸馏水试剂(1)2% 淀粉溶液 (2) 0.4mol/L 氢氧化钠 (3) pH5.6 柠檬酸