蛋白质组学实验指南.pdf

第一部分 组织和细胞蛋白样品的制备 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 组织和细胞的来源： 1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机 (40,000 g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置 1.1.3 试剂 三氯醋酸 (TCA) 丙酮 二硫苏糖醇 (DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考马斯亮蓝R350 抑肽素A 亮肽素 ●试剂纯度均应是分析纯或以上。 1.1.4 溶液配制 (1) PBS ： NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na HPO 1.44 g, KH PO ，溶于800 ml 水中，用HCl 2 4 2 4 调pH 至7.4，用纯水定容至1 L ； (2) EDTA 储存液： 18.61 g Na EDTA ·2H O，溶于70 ml 纯水中，用10 mol/L NaOH 调节pH 2 2 值至8.0 (约需2 g NaOH 颗粒) ，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用； (3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml，100×) 10 mg/ml 溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml 储液，-20 ℃保存； (4) 抑肽素储存液 (70 μg/ml，100×) 1 mg/ml 溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml 储液，-20 ℃保存； (5) PMSF 储存液 (10 mM, 100×): 17.4 mg PMSF ，溶于1ml 异丙醇中，-20 ℃ 保存。 (6) DTT 储存液 (1 M): 0.31 g DTT 溶于2 ml H O 中，-20 ℃ 保存 (DTT 或含有DTT 的溶液不能 2 进行高压处理，可过滤除菌) 。 (7) 裂解液: Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Final concentration Amount Urea (FW 60.06, 9 M 10.8 g Sigma, 99.5%) CHAPS (FW 614.89, 4% (w/v) 0.8 g Sigma, 98% Ultrapure H O to 20 ml 2 prepare fresh or store in aliquots at –20 ℃ A cocktail of protease inhibitors DTT(FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysis buffer (15.5×stock), -20 ℃ Lysis buffer B (7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer C 40 mM Tris-