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中国试剂网 3.26.7 蛋白质组实验全套流程方案 蛋白质组实验流程 双向电泳的样品的制备 样品制备原则 样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响 2-DE 结果好坏。目前并没有 一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则： 1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失； 2 ）减少对蛋白质的人为修饰；3 ）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并 使蛋白质处于完全变性状态。 根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿 素（Urea ）和硫脲（thiourea ）；表面活性剂（sufactants ），也称去垢剂，如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents ），最常用的是二 硫苏糖醇（DTT ）和磷酸三丁酯（TBP ）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base, 蛋白酶抑制剂以及核酸酶。 样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达 到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响 蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小 分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至 会损坏 IPG 胶条，这样都会造成 2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工 作的完善或改进获得补偿。 核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫； 而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离 心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬 法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。 因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进 行选择。目前有很多方法适于 2-DE ，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细胞组 份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、采用亲合 纯化凝集素结合蛋白等）。 一、细胞样品 中国试剂网 3.26.7 1. 细胞培养，加药与处理。 2. 胰酶消化贴壁细胞，PBS 漂洗 3 次(1500 ｇ，5min)，弃上清, 再次离心，去尽 残液（非常重要！）。如要比较细胞膜蛋白组的差别，最好用细胞刮收获细胞。如 用 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替 PBS ，可有效降低样品的盐浓度。 加入 5 倍体积裂解液，混匀（或将 1×106 细胞悬于 60～100µl 裂解液中）。 3. 加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase ，在4 ℃放置 15 分钟。 4. 15,000 转，4 ℃离心 60 分钟（或 40,000 转，4 ℃离心 30 分钟）。 5. 收集上清。 6. 测定蛋白浓度(采用 BioRad RC/DC protein assay kit) 。 7. 分装样品，冻存于－70℃。 二、组织样品 1. 碾钵碾磨组织，碾至粉末状。 2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。 3. 加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase ，在4 ℃放置 15 分钟。 4. 15,000 转，4 ℃离心 60 分钟（或 40,000 转，4 ℃离心 30 分钟）。 5. 收集上清，测定蛋白浓度。 6. 分装样品，冻存于－70℃。 注意事项： 1. 8 mmol/L PMSF 必须在添加还原剂之前用，否則 PMSF 会失去活性。 2. 40 mmol/L 浓度以下的 Tris 可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。 3. 细胞清洗――大多用 PBS ，若PBS 残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹， 则可利用(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此问题。 双向电泳操作步骤 水化上样(被动上样) 1. 从冰箱中取出 IPG 胶条，室温放置 10min。 2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各 1cm 左右不加样，中间 的样品液一定要连贯.注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质