基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶的体系构建.docVIP

　　基因修饰红细胞输送左旋天门冬酰胺酶的体系构建 　　为增加慢病毒滴度和转染率，在不影响重组蛋白表达的组织特异性和预期可以维持目的基因需要的表达水平的基础上，采用优化的基因调控因子，下面是小编搜集整理的一篇探究左旋天门冬酰胺酶的论文范文，欢迎阅读借鉴。 　　左旋天门冬酰胺酶(L-asparaginase，L-ASNase)是治疗淋巴细胞白血病等恶性血液病的重要药物之一。某些类型的肿瘤细胞表达的L-天门冬酰胺合成酶(L-asparaginessynthetase，L-AS)活性远远低于正常细胞，难以在胞内将氨或L-Glu的酰胺基在ATP和Mg2+存在时有效地转移至L-Asp的beta;羧基生成L-Asn，因而迫使这类肿瘤细胞利用外源Asn以维持胞内蛋白质合成与细胞增殖;而L-ASNase可水解Asn(必需氨基酸)为Asp和氨，由于人体内不存在天然L-ASNase，若向患者体内引入L-ASNase，全身性降解Asn，可使这类肿瘤细胞因L-AS活性低，不能独立合成Asn，造成Asn饥饿，导致蛋白质的生物合成紊乱而死亡，达到在不影响正常细胞生理功能的前提下杀伤肿瘤细胞的目的。但L-ASNase是异源酶，免疫原性易致人体产生灭活酶的抗体，且不良反应较大，因此亟待研发低免疫原性L-ASNase给药方案。目前有临床试验将L-ASNase用急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，ALL)复发患者的自体红细胞(redbloodcell，RBC)封装后再自体回输，该给药方案在理论上可消弱L-ASNase的抗原性，阻碍治疗性酶被宿主蛋白水解酶降解;在临床上也观察到可降低ALL复发患者抗-L-ASNase抗体的形成，明显减弱过敏反应、凝血功能障碍和肝功能失常，改善了病患的健康状况。然而，这种用非基因修饰方法将药物封装进RBC的方案或多或少均改变了RBC的形态和细胞膜特征(如易碎、变形性下降等)，增加了机体清除这部分RBC的机率。 　　由于造血干细胞在体外向红细胞定向分化需时较长，若向造血干细胞中引入L-ASNase基因，可以使其在定向分化过程中开始表达L-ASNase，克服红细胞生命力短暂、难以在体外长期存活之弱点，延长药物时效，为寻找合适的分化期导入体内遏制ALL奠定基础。 　　在本研究中，我们用携带L-ASNase的红细胞特异性重组慢病毒载体系统包装出自灭活(self-inactivation，SIN)重组慢病毒，以小鼠红白血病(murineerythroleukemia，MEL)细胞经诱导可向红细胞终端分化为模型，探讨重组慢病毒感染后MEL细胞在分化过程中表达L-ASNase目的基因，延长药物时效的可行性。 　　1、材料与方法 　　1.1材料 　　人胚胎肾(humanembryonickidney，HEK)293T细胞、MEL细胞、小鼠成纤维细胞NIH/3T3和稳定表达对照病毒RRL-sEF1alpha;-GFPLuc的NIH/3T3细胞、人宫颈癌HeLa细胞为本课题组保存;大肠杆菌DH5alpha;、包装质粒psPAX2、包膜蛋白质粒pMD2.G、转移质粒RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2(-)、RRL-sEF1alpha;-L-ASNase-2A-mCherry和RRL-sEF1alpha;-2A-mCherry为本课题组保存。 　　各种限制性内切酶为Neethylenebisacetamide，HMBA)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)和聚凝胺(polybrene)为Sigma公司产品;兔抗大肠杆菌L-ASNase多抗为GeneTex公司产品;小鼠抗mCherry单克隆抗体为EarthOx公司产品;青霉素和链霉素溶液(以下简称双抗)为Hyclone公司产品;InstaGeneMatrix为Bio-Rad公司产品;荧光定量(TaqMan)快速PCR混合试剂盒(2)为ABI公司产品;哺乳动物细胞总蛋白抽提试剂(mammalianproteinextractionreagent，M-PER)、2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量分析试剂盒为Pierce公司产品;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和键合了Alexa488的山羊抗兔IgG为AffinityBiologicals公司产品;标准品L-ASNase为日本协和发酵麒麟株式会社产品。 　　1.2慢病毒转移载体的设计和制备 　　RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2(-)的结构(图1)中，为方便监测目的基因的表达，将编码L-ASNase的cDNA通过2A联接体技术与编码红色单体荧光蛋白mCher