园艺植物生物技术第六章.ppt

we have been facing genetic improment for many charaters of horticulture plants。 Genetic Improvement methods crossbreeding(backcross) Mutation Breeding Somatic Hybridization： Selection in Breeding phenotype-based：P=G+E molecule assisted selection Contens Nucleic acid extraction Gel electrophoresis Polymerase chain reaction(PCR) Molecular hybridization Deoxyribonucleic acid，DNA) Ribonucleic Acid，RNA mRNA rRNA tRNA 生物遗传的物质基础，决定了生物体的遗传、变异、生长和发育。 基因工程和分子标记主要的研究对象。 核酸的质量（纯度、完整性）直接关系到研究的成败。 1. Nucleic Acid Extration genomic DNA 1.1.2 SDS method SDS Extration Buffer Procedure 取幼嫩材料0.2g，洗净，吸干表面水分，放入预冷研钵中，加液氮研磨至粉末状，转移粉末到1.5ml离心管中。 向管中加入900μL SDS提取缓冲液，轻轻混匀，再加入100μL 10%SDS，充分混匀，65℃保温10~15min （期间晃动2-3次）。 加入160μL 5mol/L KAc，混匀，置冰上30 min。 4℃,12 000rpm离心15min,转移上清到一新离心管中。 加等体积的氯仿/异戊醇，混匀后，静置10min ，10000r/min离心10min，转移上清液。 加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min 。 用70%乙醇洗涤沉淀DNA 3次后，晾干。 加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA，低温保存。 Attention： Simplifying: 缩短过程，减少对核酸破坏； Reducing damage by chemical: 操作在pH4－10条件下（过酸过碱破坏磷酸二脂键）； Reducing damage by physical factors:包括机械剪切力，高温，所以常规操作0－4℃； Avoiding degradation by nuclease:DNA酶需要Mg2+,Ca2+激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙二酸(EDTA)，柠檬酸。 1.2 RNA Extration Avoid degradation by RNAase Inhibiting exogenous RNAase： 水、溶液、塑料制品等：0.05%~0.1%DEPC(焦炭酸二乙酯）37℃处理12h，最后用高压灭菌去除残留DEPC。 玻璃器皿：200 ℃烘烤3h以上。 Inhibiting endogenesis RNAase： Protease inhibitor（酚、氯仿、异硫氰酸胍） RNAase inhibitor（氧钒核糖核苷复合物、RNAasin) 1.2.1 Extraction for total RNA 苯酚（phenol）法： 苯酚协助破碎细胞； 酚/氯仿变性蛋白并反复抽提核酸； 3mol/L乙酸钠沉淀RNA； 4-氨基水杨酸与三异丙基萘硫酸盐抑制RNAase活性。 1.2.2 Isolation of mRNA 总RNA流经Oligo(dT)纤维素层析柱； 高盐缓冲液（0.5mol/L NaCl）下，mRNA3’端poly(A)残基与连接在纤维素层析上的Oligo(dT)配对，形成氢键，使mRNA被吸附在柱上。 最后用低盐缓冲液或蒸馏水洗脱。 2. Gel Electrophoresis 2.1 Agrose gel electroresis 琼脂糖凝胶电泳 Agrose(琼脂糖)：linear polymer extracted from seaweed. Agrose gel are cast by melting in the desired buffer.On hardening, the agrose forms a matrix. When an electric field is applied aross the gel, DNA migrates towards the anode. 浓度越高→孔隙越小→分辨力越强。 Buffer(缓冲液)： T