微生物学实验目的与要求.doc

实验九 其他微生物 目 的 （一）掌握病原性真菌的基本形态、培养特性（单细胞、多细胞），浅部真菌临 床标本检查原则。 熟悉钩端螺旋体的形态和染色。 了解沙眼衣原体、肺炎支原体、立克次体的形态及肺炎支原体培养的菌 落特征。 内 容 录像：真菌 真菌形态、菌落、浅部真菌病临床标本检查、真菌小培养法（示教与操 作）。 螺旋体（示教及操作）。 肺炎支原体（示教）。 沙眼衣原体（示教）。 立克次体（示教）。 录 像 真菌培养方法、检查方法、浅部真菌病人指甲、毛发如何检查，白假丝酵母及新型隐球菌形态特征、培养、病人标本检查。 二、真菌形态、菌落等 （一）菌的基本形态（示教） 【材料】多细胞真菌的棉蓝染色片，白假丝酵母革兰染色片。 【方法】 1．单细胞真菌形态示教片油镜检查。 白假丝酵母：卵圆形，革兰氏染色阳性，可见假菌丝。 2．多细胞真菌形态示教片，低倍或高倍镜观察。 注意观察不同形态的大分生孢子、小分生孢子及菌丝。 （二）真菌的菌落（示教） 【材料】 白假丝酵母斜面培养物一支、多细胞真菌斜面培养物2－3支。 【方法】 观察菌落的形态、性质、色素等特点。 白假丝酵母菌落为类酵母菌落，菌落为圆形，较大，白色，菌落底层有假菌丝 培养基内。 多细胞真菌菌落为丝状菌落，观察不同多细胞真菌的气中菌丝，菌落表面的隆起和浅沟以及菌落基底背面的颜色。 （三）真菌的小培养法（示教） 【材料】回形针、沙堡氏培养基、石蜡、无菌滴管、载玻片、接种针、多细胞或单细胞真菌斜面培养物。 【方法】 1．取回形针用镊子弯成圈形或方形，其外周不超出盖玻片之边缘，直径约为19毫米，回形针圈通过火焰灭菌。 2．取盖玻片（22平方毫米），火焰灭菌，用熔化的石蜡将回形针圈粘着于盖玻片上。 3．用无菌吸管滴一滴熔化的沙堡氏培养基于回形针圈内。 4．用接种针取菌种少许，接种于培养基上。 5．翻转盖玻片，置经火焰灭菌的载玻片上，用石蜡封固，但下边的开口不封，使其有充分空气通入。 6．置无菌培养皿内，载玻片用玻璃管架起。皿内稍盛清水，以维持湿度。 7．置室温培养，数日后即可逐日观察其生长发育情况。 （四）浅部真菌病临床检查（操作） 【材料】病发或足癣患者的皮屑，10～20%KOH溶液，小镊子、载玻片及盖玻片。 【方法】 1．标本的采集：采集发癣标本时，用镊子选拔病损部位的断残头发或带白色菌鞘的毛发，损害处断发或边缘的脱屑最易获得阳性结果。黄癣痂亦易得阳性结果。如采取足癣标本时则用小刀刮取损害边缘部皮屑；若是趾间有损害，选择潮湿或干裂皮屑。用过的镊子或小刀立即经火焰灭菌。 2．标本的处理：将病发或皮屑放于玻片上，滴1～2滴10~20％KOH溶液，加以盖玻片，在火焰上稍加热往返数次，放置10分钟用手轻按一下盖玻片，若能使之压平即可镜检（时间过长或加入KOH溶液过浓，都可致使毛发被破坏）。 3．镜检：将处理完毕的标本，先在低倍显微镜下观察到检查物后，换用高倍镜观察。观察有无菌丝、孢子及菌丝孢子的特点。 三、螺旋体 （一）螺旋体形态及染色（示教） 【材料】梅毒螺旋体示教片，钩端螺旋体示教片。 【方法】 1．梅毒螺旋体示教片用Fontana镀银染色。梅毒螺旋体非常细小，螺旋体呈棕褐色，仔细观察可见到有紧密的螺旋8~14个。 2．钩端螺旋体示教片系钩端螺旋体纯培养涂片。用于Fontana镀银染色法染色，镜下可见棕褐色的两端有钩，类似S型的螺旋体，螺旋不太清楚。菌体整齐、细粗均匀。 （二）暗视野观察钩端螺旋体（示教） 【材料】 1．菌种：钩端螺旋体培养物 2．盖玻片（0.16毫米以下）、薄载玻片（1.5毫米以下）、暗视野集光器，虹彩光阑或特制油镜头、强光灯。 【方法】 取下普通光学显微镜上原有的明视野集光器，并使其顶面与载物台相平。 卸下油镜头，添加一虹彩光阑或换以附有缩放光阑的特制油镜头。 取2－3环菌液，放于薄载玻片上，加上盖玻片。 在暗视野集光器上加香柏油一滴，然后将次台略下移。 置标本片于载物台上，上升集光器，使其表面的镜油与载玻片相接触，勿使发生气泡。 转动反光镜，使光线集中于暗视野集光器上，用低倍镜观察。当视野中有 一圆形光环出现时，转动集光器上的调节器，将光环移置于视野中心。 另加香柏油一滴于盖玻片上，以油镜检查。 （三）口腔螺旋体墨汁涂片检查法（操作） 【材料】墨汁、牙签、载玻片。 【方法】 取玻片一张，用接种环取2~3环墨汁，置于玻片的一端。 用牙签从齿龈部取牙垢少许，与墨汁混匀作一推片。 干后，油镜检查，片中整个视野呈黑色，各种形态的细菌和螺旋体不被染色，呈透明、不染色的菌体。 四、肺炎支原体（示教） （一）支原体在固体培养基上的特点（示教） 【材料】肺炎支原体平板培养物或菌落照片。 【方法】 1．取培养物平板，倒置于带人工光源的显微镜台上，用低倍镜（10~40倍左右）