放射性粒子125I对胶质瘤细胞治疗作用的实验研究-第三军医大学学报.doc

放射性粒子125 I对胶质瘤细胞治疗作用的实验研究 潘宝根1 赵文清1，2 李文玲2 王跃红1 边艳珠3 （1河北医科大学神经外科教研室；2河北省人民医院神经外科；3河北省人民医院核放射科） 关键词：　胶质瘤；放射性同位素125I；裸鼠；凋亡 胶质瘤的治疗仍是目前神经外科学界的难题之一。尽管近些年来在手术、放疗、化疗等方面不断取得进步，然而几十年来胶质瘤的平均生存期并没有明显改观（1）。80 年代后期,随着释放低能γ射线的放射性核素研制成功,间质内放疗逐渐被广泛应用于临床，并在胶质瘤的治疗上取得一定效果。本研究在建立皮下荷U251人胶质瘤的裸鼠模型基础上，瘤内植入125 I粒子，观察肿瘤的体积变化，探讨间质内放疗后的肿瘤细胞凋亡，为其进一步临床应用提供依据。 1　材料与方法 1.1材料 U251人胶质瘤细胞株：购自中国科学院上海细胞生物学研究所，用达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基加10%的胎牛血清（DMEM-10）在5% CO2， 37oC的培养箱中进行培养。细胞换液时间为1～2 d ,每3～5 d 传代1 次,传代前用0.25 %胰酶消化。 放射性粒子125 I：为上海欣科医药有限公司惠赠，活度为0. 8mCi,半衰期为60. 2 d,释放27～35 keV的X射线和35. 5 keVγ射线。 实验动物：采用4周龄的Balb/c雄性无胸腺裸小鼠，共24只，体重14-18g，购自北京大实验动物学部，饲养于石家庄市和平医院SPF级无菌净化室内。 1.2 方法 1.2.1 接种部位 为裸鼠后腿皮下。整个接种过程在层流超净台中进行。75 %酒精消毒局部皮肤后, 缓慢皮下注射5×107有活力的U251人胶质瘤细胞悬液。依据计算公式[2]:V(体积) = L ×W2/2 (L 为肿瘤最长径,W为与L 相垂直的最宽径) 求得移植瘤的体积。约40天左右当肿瘤长到200mm3时，随机分为2组：第一组12只，为对照组；第二组12只，为125 I治疗组。严格局部皮肤消毒后,于裸鼠后腿肿瘤正中处，在皮上切开小口，直视下肿瘤内植入125I粒子（治疗组）或空壳（对照组），每个瘤内均为1枚。定期记录肿瘤体积变化，30 d后处死动物结束实验。实验后粒子集中收集处理,处死动物按常规处理。 1.2.2 透射电镜观察 将约1 mm3的组织块立即放入3 %戊二醛固定,再用1 %锇酸固定后,梯度乙醇、丙酮逐级脱水,环氧树脂丙酮渗透,纯环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色,在EM1230 透射电子显微镜下观察细胞超微结构并拍照。 1.2.3 流式细胞仪检测 将肿瘤组织剪碎后，制成单细胞悬液，PBS 液冲洗,0.125 %胰酶消化2 min 后用PBS 将细胞从瓶壁吹下,1 500 r/ min 离心5 min ,75 %乙醇固定,以100 目筛网过滤后再离心(1 500 rpm/ min) 5 min ,加入碘化丙啶(PI)015 mL (工作浓度为10 μg/ mL) ,室温闭光30 min ,上机。收集2 万个细胞,荧光强度以线性放大,数据在Macintosh650 计算机上用Modifit 210 软件分析。检测各组U251细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达。 1.2.4 统计学方法 用STATE8.0统计软件进行处理。 2 结果 2．1 两组胶质瘤的体积比较。 植入粒子15 d时，治疗组肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤体积开始逐渐缩小，两组比较差异明显（p 0.05）；20 d以后两组肿瘤大小差异则极为显著（p 0.01）,见表1。 表1 植入粒子后治疗组和对照组肿瘤的大小比较（χ±s mm3,n=12) 0 d 5 d 10 d 15 d 20 d 25 d 30 d 对照组 203.1±5.6 256.7±34.6 315.8±50.4 392.4±67.8 479.2±86.5 609.7±112.4 781.6±160.8 治疗组 202.4±5.9 255.9±41.7 289.7±47.2 302.5±54.9a 265.4±57.7b 212.6±49.6 b 163.3±41.2 b a：与对照组比较 p 0.05；b：与对照组比较p 0.01 2.2 电镜形态 电镜下可见对照组切片上肿瘤细胞增生活跃，核分裂相多见（图1）,而治疗组切片除可见辐射造成的细胞损伤，细胞外胶原纤维成分明显增多及大面积坏死外，还可见较多凋亡细胞，具有凋亡的特征性细胞变化：核周隙变宽，染色质密集，位于皱缩的核膜下，即染色质边缘化；胞质内细胞器变致密，滑面内质网扩张及线粒体扩张（图2～3）。 2.3 流式细胞仪检测各组U251细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达 治