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一、分光光度法的特点二、可见分光光度法与紫外的区别三、分光光度计测定物质含量的原理四、工作曲线法测定芦丁含量五、本次实验注意事项六、仪器的操作 分光光度法的特点(包括紫外和可见) 分光光度法与其他测定方法比较有这样一些特点 1、首先,它的应用广泛,在国际上发表的有关分析的论文总数中,分光光度法占28%,我国约占所发表论文总数的33%。 2、灵敏度高,由于新的显色剂大量合成,并在应用研究方面取得了重要进展,使得测定物质的灵敏度提高。 3、选择性好,目前有些元素只要控制适当的显色条件就可以直接进行光度法测定。 4、准确度高,浓度测量的相对误差在1~3%范围 5、分析成本低,操作简便快速。 可见分光光度法与紫外的区别: 1、光源不同,紫外用氢灯作光源,可见用钨灯 2、测定波长不同,紫外波长范围180~350nm 可见波长范围320~1000 3、可见需显色,紫外不需显色 可见分光光度测定中通常是被测物质与显色剂反应,生成有色物质,然后测定其吸光度,进而求得被测物质的含量。 分光光度计测定物质含量的原理: (紫外与可见基本相同) 均采用一个能产生多个波长的光源,通过系列分光装置后产生特定波长的光源,光源透过被测样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,由比尔-朗白定律求得样品的浓度。 实验八 工作曲线法测定芦丁含量 可见分光光度法 一、实验目的 (1)掌握可见分光光度计的使用 (2)掌握光电比色的一般操作。 (3)学会用作图法及计算器回归 法求芦丁样品的浓度 芦丁又名芸香甙,维生素P,属黄酮类化合物,临床上主要用于治疗脑溢血,高血压,视网膜出血等疾病。 芦丁的含量测定有高效液相色谱法,紫外分光光度法和可见分光光度法。 二、实验原理 黄酮类化合物的结构性质 结构中含有酚羟基和环酮基结构,可与某些金属盐试剂生成有色络合物,在510nm波长处有吸收,用可见分光光度计测其含量。 本实验利用什么原理 本实验利用黄酮甙与亚硝酸钠、硝酸铝反应在碱性时显红色的反应测定芦丁的含量。 要使得测定浓度准确应当考虑影响测定准确的因素: 1 显色反应的完全程度(取决于): 介质的pH 显色剂的用量 反应温度 反应时间 2 吸光度的物理测定条件 如何确定反应最佳条件 在建立方法时,需要通过实验确定最佳反应条件,为此改变其中一个因素(例如介质的pH值暂时固定其他因素,显色后测量相应溶液的吸光值,通过吸光度-pH曲线确定反应的酸度范围,其他几个影响因素的适宜值也可以按这一方法分别确定。 三、实验内容 仪器 光电分光比色计 使用方法见附件 比色皿的校核 将同样厚度的四个比色皿分别编号标记,都装空白溶液,在所用波长(510nm)下比较各比色皿的透光率,应相同,若有显著差异,应将比色皿重新洗涤后再装空白溶液测试,经洗涤可使透光率的差异减小时,可通过多次洗涤使透光率一致。若经几次洗,仍然不一致可如下校正:以透光率最大的比色皿为100%透光,测定其余各皿的透光率,分别换算成吸收度作为各比色皿的校正值。测定溶液时,以上述100%透光率的比色皿作空白,用其他各皿装溶液,测得吸收度值然后碱去所用比色皿的校正值。 芦丁的测定(标准曲线制备与芦丁测定一起完成) 精密移取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml和样品液3.0ml置10ml容量瓶中→各加30%乙醇使成5.0ml→各精密加入亚硝酸钠溶液(1→20)0.3ml,摇匀,放置6分钟→各加硝酸铝(1→20)0.3ml,摇匀,再放置6分钟。→各加氢氧化钠试液4ml,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,放置15分钟。 在510nm波长下测定各瓶溶液的吸收度(以第一瓶作空白)以浓度为横坐标,吸收度为纵坐标,绘制标准曲线。测定样品的浓度。 芦丁的测定各试剂用量 结果 1、列出浓度C与吸光度A对应表格 2、用作图法绘制芦丁工作标准曲线 3、用计算器回归求标准曲线方程A=()C+( ), 要求r=0.998以上 4、从图中读出芦丁的浓度,并计算瓶中芦丁样品的浓度 5、计算器回归求芦丁样品的浓度并计算瓶中芦丁样品的浓度。 注意事项 移液管,容量瓶的正确使用 NaOH每吸一次可以放两个,比色杯不要甩 容量瓶易翻倒,注意放好 注意放的时间 NaNO2加0.3ml,不是0.03ml. 标准浓度看黑板,各浓度要计算 蒸馏水要加至刻度后摇(用滴管),容量瓶拿在手上看刻度 浓度的测定,以1号为空白,从低浓度至高浓度来测. 数据当场交,报告回去做. 四、思考题 相同厚度的各比色皿透光性不一致时,为什么要在经过多次洗涤后各皿透光率差异无改变下才使用校正值? 工作曲线法和标准对比法分别适用何种情况?从本实验结果看,能否用标
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