药典三部(2015版)-通则-3301支原体检查法.pdfVIP

3301 支原体检查法 主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支 原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞培养法（DNA 染色法）。病毒类疫苗 的病毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞培养法 筛选培养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。 第一法 培养法 推荐培养基及其处方 ⑴ 支原体液体培养基 支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 氯化钠 2.5g 牛肉浸液（1 ︰2 ） 500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g pH 值7.6±0.2 。于121℃灭菌15 分钟 精氨酸支原体肉汤培养基 猪胃消化液 500ml 葡萄糖 1.0g 牛肉浸液（1 ︰2 ） 500ml L-精氨酸 2.0g 酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g 氯化钠 2.5g pH 值7.1±0.2 。于121℃灭菌15 分钟 ⑵ 支原体半流体培养基 按⑴项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂 2.5～3.0g 。 ⑶ 支原体琼脂培养基 按⑴项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂 13.0～15.0g。 除上述推荐培养基外，亦可使用可支持支原体生长的其他培养基，但灵敏度 必须符合要求。 培养基灵敏度检查（变色单位试验法） ⑴ 菌种肺炎支原体（ATCC 15531 株）、口腔支原体（ATCC 23714 株），由国家药品检定机构分发。 ⑵ 操作 将菌种接于适宜的支原体培养基中，经36℃±1 ℃培养至培养基变 色，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中，做 10 倍系列稀释，肺炎支原 -7 -9 -3 -5 体稀释至10 ～10 ，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10 ～10 ， 接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种 3 支试管，置 36℃±1 ℃培 养7～14 天，观察培养基变色结果。 ⑶ 结果判定 以接种后培养基管数的2/3 以上呈现变色的最高稀释度为该 培养基的灵敏度。 -8 液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531 株）应达到10 ，口腔支 -4 原体（ATCC 23714 株）应达到10 。 检查法 ⑴ 供试品如在分装后 24 小时以内进行支原体检查可贮存于2～8℃；超过 24 小时应置-20 ℃以下贮存。 ⑵ 检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基（或支原体琼 脂培养基）。半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15 分钟，冷却 至56℃左右，然后加入灭能小牛血清（培养基︰血清为8 ︰2 ），并可酌情加入适 量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。 取每支装量为10ml 的支原体液体培养基各4 支、相应的支原体半流体培养 基各2 支（已冷却至36℃±1 ℃），每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃±1 ℃ 培养21 天。于接种后的第7 天从4 支支原体液体培养基中