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植物单细胞培养概论 一、植物单细胞培养相关概念 1、植物的单细胞培养： 在适宜的条件下，一个来自已分化的根、茎、叶等组织的细胞，经过离体培养可以发育成同其亲本一样的完整植株。 植物组织培养技术的重要理论基础是植物细胞的全能性 植物的单细胞培养，在无菌和人为控制外因的条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整个植株的技术。 2、愈伤组织： 原指植物体受伤时产生于伤口周围的组织。现多指切取植物体的一部分，置于含有生长素和细胞分裂素的培养液中培养，诱导产生的无定形的组织团块。 3、外植体： 把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体 二、植物组织培养特点及其意义 特点： ①培养条件可以人为控制 ②生长周期短，繁殖率高 ③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 意义：①研究细胞生理代谢过程及各种影响因子； ②用于植物品种的改良； ③用于植物次生代谢物质的生产 三、细胞培养的主要内容 1、单细胞培养（Single cell culture） 2、悬浮培养（Suspension culture ） 3、细胞培养实验室器材 简介 第一节：单细胞培养 （Single cell culture） 单细胞的分离 单细胞的培养方法 影响单细胞培养的因子 ?单细胞的分离 从外植体中直接分离单细胞 从愈伤组织中分离单细胞 通过原生质体再生法获取单细胞 通过原生质体再生法获取单细胞 外植体、愈伤组织或细胞团通过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁得到原生质体。 特点： 有利于有毒物质的扩散； 有利于气体交换； 不利于定点观察； 单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。 2、固体平板培养法 2-1 含义及用途： 含义： 是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。该方法是Bergmann(1960年)首创。 用途：是为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。 （3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板，盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。 (4) 培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显微镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。 植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。 植板效率= ×100% 2-4 平板培养必须注意的方面 （1）选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在低的初始植板密度下使细胞生长。 （2）不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛时期的细胞才有最高的植板率。 （3）在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不同。如：烟草细胞适宜的为5~10 ×10 3 个/ml,若低于此数则植板率显著下降。 （4）接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 ℃ 。 3、看护培养法 3-1 看护培养的含义及用途 含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 用途；诱导形成单细胞系。 Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。 3-2 看护培养基本技术 （1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。 （2）在无菌的条件下，先将一小块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm2）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。 （3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。 （4）恒温培养。 3-4 特点： 1）效果好，易于成功。 2）简便易行。 3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。 注意：要得到单细胞系必须保证接种材料是真正的单细胞。 4-1 微室培养的含义及用途 含义：即将细胞培养在很少量的培养基中。 用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。 2.1.2 特点 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目 不断发生变化，呈S增长。 必须适当搅拌 2-2 连续培养（Continuous culture) 2.2.1 含义：是相对分批培养而言的。连续培养是采用有效的措施让微生物在某特定的环境中保持旺盛生长状态的培养方法. 2.2.2 特点:：①高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；②自