20140313小组报告westernblot.pptxVIP

;;Western印迹法包括直接法和间接法;实验原理 ● 将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 对不同分子量的蛋白质进行分离； ● 将分离到的蛋白质通过转移电泳方式转印至固相支持物上(PVDF膜、NC膜或尼龙膜上) ； ● 用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印膜进行反应，使其与膜上的靶蛋白发生特异性结合； ● 结合上的抗体与辣根过氧化物酶标记的二抗 进行结合; ● 经ECL发光试剂作用、X-光片曝光、显影既可显示与特异抗体结合的靶蛋白条带。 ;;;1 蛋白样品的制备;;;;;;;不连续电泳：;凝胶成分;凝胶成分主要作用;4.SDS; SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度. ;SDS操作过程 灌制分离胶 隔绝空气;灌制浓缩胶 插入梳子 ;;3 转膜;湿转系统; ◆ 转膜步骤 ● 　PVDF膜预处理：剪裁与胶大小一致的PVDF膜，将其浸入甲醇液中浸泡30sec 。 ● 剪裁与胶同样大小的6层滤纸，用转移缓冲液打湿后待用。 ●　电泳结束后由电泳槽上取下电泳板，将其平置,小心掀去上层玻璃板，切除多余凝胶