Ecoli转化子的筛选与验证.docVIP

E.coli转化子的筛选与验证 实验目的 掌握使用红白菌落法筛选获得重组子的方法，了解红白筛选的原理。学习用用试剂盒法对重组子进行重组质粒的抽提，并对其进行酶切鉴定，以确定重组质粒中含有外源DNA片段。 实验原理 因pUC19质粒（pBS）带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有氨苄青霉素（Amp）的LB平板上存活下来；而只带有自身环化的外源片段转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS上带有(-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和(-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能，E.coli DH 5(菌株带有(-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，pBS和DH5(融为一体的(-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5(融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的(-半乳糖苷酶阴性突变体之间可以实现互补的现象叫(-互补。 在麦康凯培养基上，(-互补产生的Lac+细菌由于含(-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去(-互补能力，因而不产生(-半乳糖苷酶，无法分解培