粉蚧科无损形态基因组DNA提取技术.pdfVIP

第7卷第4期 热带生物学报 Vo】．7No．4 BIoLoGY Dec．2016 2016年12月 JOURNALoFTRoPICAL 文章编号：1674—7054(2016)04—0497—03 粉蚧科无损形态基因组DNA提取技术 叶琳雄，符清流，胡 荣，李加慧 (海南大学环境与植物保护学院，海口570228) 摘要：以双条拂粉蚧(FerrisiaCockerell)为研究对象，采用蛋白酶K代替粉蚧玻片标本制作中的 virgata 10％KOH用于组织消化，消化液用试剂盒法进行基凶组DNA提取，剩余虫体进行玻片制作；同时比较了虫体 全研磨、腹部微针tLTL与虫体不做任何处理共3种处理方法提取基凶组DNA的效果。结果表明：3种处理方 法均可成功提取基因组DNA，后2种方法处理后的剩余虫体可制作成玻片标本，实现了粉蚧无损形态的基因 组DNA提取技术，为粉蚧的DNA条形码和系统发育研究提供了技术保障。 关键词：粉蚧；基凶组DNA；提取；无损形态；DNA条形码 中图分类号：S433．3 文献标志码：A DOI：10．15886／j．cnki．rdswxb．2016．04．015 基于粉蚧形态特征分类研究中遇到的复杂情况，如其形态完整性、受环境因素影响而诱发形态变异【2o，给 粉蚧的鉴定增加了难度。采用分子生物学技术开展昆虫种类鉴定，不受雌雄性别和发育阶段的限制，具 有简便、快速、高通量等特点。目前，利用DNA片段序列进行粉蚧的分子鉴定和系统发育逐渐得到广泛 应用。3‘5J。粉蚧个体小，目前，国内学者通常采用整头粉蚧或切取部分虫体组织加液氮研磨的方法进行基 因组DNA的提取。6吲，该方法部分或完全破坏了虫体的形态特征，给后续标本验证和形态学研究带来不 虫的无损形态基因组DNA提取；解萌等亦将此提取法应用在鞘翅目昆虫上¨2‘。粉蚧的分类鉴定依赖玻 片标本，制作玻片标本首先需要利用10％的KOH溶液对虫体内部组织进行消化后进行后续制作流程。 玻片标本与基因组DNA提取的实验虫体如非同一个体，极可能影响粉蚧的准确鉴定。本研究利用蛋白 的无损形态基因组DNA提取技术，解决珍稀标本或检疫部门收集的单头标本形态研究和分子鉴定不能 两全的难题，旨在为粉蚧的分子鉴定和系统发育研究提供技术依据。 1材料与方法 1．1 研究材料供试的双条拂粉蚧(Ferrisia virgata 采集后放入无水酒精保存，返回实验室后更换球酒精，于一20℃保存。选取个体大小相近的粉蚧9头，3 头为1组，分别进行3种提取前处理：A．整头粉蚧研磨；B．解剖镜下用微针在虫体腹部中央扎1个小孔； C．虫体不做前期处理整头标本直接进行组织消化。 液／细胞／组织基因组DNA提取试剂盒”对每头粉蚧分别进行基因组DNA提取。提取步骤做如下调整： 收稿日期：2016—07—13 金项目；国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2016IK094) 通信乍者：李加慧(1984一、．男．译1：、j““誓索+“8．尘系统学”_ail：jiahuilil984@qq．com 万方数据 热带生物学报 2016年 20灿蛋白酶K56℃消化过夜，然后用灭菌的钝头竹签将B，C2组提取前处理的粉蚧挑出，置于凹面皿 上用于后续的玻片标本制作。裂解液则参照试剂盒说明书，完成基因组DNA的提取。基因组DNA提取 2000 Fisher 完成后取i¨L提取的样品基因组DNA利用NanoDrop Scientific公司，美国)测定各样品的质量浓度。 1．3 因组DNA拘质量进行测定。扩增引物参照Park【13]，目标片段约650