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应用说明 Applied Biosystems 3500/3500xL基因分析仪 利用Sanger毛细管电泳测序验证二代测序 (NGS)技术发现的新变异 关键发现 • 在严谨的科学研究中，有必要对从二代测序系统获 得的测序数据进行验证 • 通过毛细管电泳法(CE)开展的Sanger测序是对NGS 碱基识别结果进行验证的理想正交测试法 • 我们针对NGS数据的CE验证操作开发了一项易用的 综合工作流程 二代测序(NGS)分析已经彻底改变了我们对于生物过 程的理解。在许多基础科学或临床领域的研究中，科 研人员通过比较不同实验组基因DNA 序列之间的差 [1] 。因此，在从NGS研究中得出任何确凿结论之前， 异，获得了许多重大发现。在这些研究中，研究者们 用户使用NGS技术所鉴定出的任何潜在变异都应通过 尝试在不同实验组之间鉴定出那些在疾病易感性，疾 一项正交检测法进行验证。 病发展过程或表型变异中可能发挥作用的核酸序列变 异。因此准确识别序列变异将有助于确保实验结果的 本篇应用说明列举了相关的信息，来帮助科研人员 成功。但是，由于NGS技术中使用的文库制备方法和 使用第二代测序数据来进行结果验证。我们展示 试剂，易产生低水平但可检测的测序误差，因而会造 了为何结果验证操作是NGS 数据分析的一项重要 成对实验结果的混乱或错误的解读。举例来说，一项 组成部分。此外，我们还展示了如何使用A pplied 最近的研究发现NGS技术所测得的变异中有多达2% Biosystems ™品牌组合中的试剂和系统开展NGS结 难于重复，因此需要使用Sanger测序法进行额外验证 果的正交验证操作。 为何对NGS数据进行正交验证操作如此重要？ 基于Sanger毛细管电泳的测序解决方案 基于系统的测序偏性 在过去的四分之一个世纪的时间里，基因组研究团体 仅在同一平台上重复测序操作对于验证NGS结果来说 的重要研究手段之一即为Sanger测序技术：通过荧光 是不充分的。重复测序不会消除所有误差，这是由于 标记的双脱氧核苷酸终止聚合酶反应，之后再通过自 所使用的测序平台可能存在特有的测序偏性所致。举 动化的毛细管电泳(CE)设备完成序列收集工作。这是 例来说，GC 富集区可能特别难于读通。因此这些区 一种强大而又经济的检测方法，其中所使用的化学法 域可能引发碱基的错误掺入，这一特殊错误类型的发 和分析工具也很简便和易于理解-同时由于该方法 生频率可能随着用户所使用不同测序系统的变化而变 具有高度的精确性和方便的数据诠释操作，它已成为 化[2] 。类似地，测序进程通过同聚序列时也可能发生 DNA测序分析技术领域的金标准。因此，该技术是对 错误[2] 。此外，文库制备法也会造成潜在的系统偏性 NGS平台所识别变异进行验证的理想系统。我们拥有 (即链偏性) [3] 。最后，不同的.bam文件比对和变异识 CE测序改进的前沿技术，并能匹配用户在CE测序方 别软件也可能生成不同(错误)结果，即使对于 “相对 面的需求来提供完整的解决方案。从查询和提供预先 简单”的单核苷酸变异(SNV)也是如此[4 ,5] 。在各类 设计好的扩增引物与PCR试剂，到BigDye终止子测序 系统之间，这些不同类型错误的发生频率和形式均有 试剂盒混合物和毛细管电泳平台，乃至最终的数据分 不同。所以，通过在同一测序平台上简单开展重测序 析软件，Applied Biosystems™的产品全面涵盖了整 是无法解决这些问题的。因此用户需要使用另一不含 个CE工作流程( 图1) 。在下列章节中，我们专门为所 同种系统偏性的测序平台，以重新分析来进行序列变 选的试剂、CE系统和工作流程提供了详细的信息， 异的验证操作。 这些条件信息均针对NGS数据的Sanger CE测序验证 应用进行了优化。 不均匀的覆盖度可能导致序列准确度不均一 另一个不确定性的来源可能由NGS测序数据的不均匀 的覆盖度所导致。NGS分析中所存在着覆盖度不均匀 的问题，是因为在客观上这一技术无法以同种效率完 成对所有序列的测序。当聚合酶读取一段拥有二级结 Tool 构的序列，高度