3动物细胞工程制药.pptx

第三章 动物细胞工程制药;第一节 概述;;二、动物细胞工程制药的基本概念;动物细胞培养的产物 ;;;;;（二）动物细胞培养的环境条件 1.温度。 2.Ph。7.2-7.4 酚红 3. 通氧量，需CO2 4.防治污染。支原体、抗生素。 5.基本营养物质 6.渗透压 ;（三）动物细胞的培养特征 1.比微生物细胞大，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差。 2.倍增时间长，生长缓慢，易污染，培养时添加抗生素 3.培养基要求高，易污染。 4.培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在。 5.产物分泌性 6.蛋白后修饰;动植物细胞培养与微生物培养性能的相比;细胞培养基本技术;动物胚胎或幼龄动物的组织、器官;;细胞的冻存与复苏;冻存和复苏的原则：慢冻快融;第二节 生产用动物细胞;;2.传代细胞系(passage cell) 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株(continuous cell lines, CCL)。 染色体组型是2n的核型,二倍体细胞系 具有贴壁依赖和接触抑制的特性 有限的增殖能力，50代 无致瘤性 一般从胚胎中获得，有限传代;WI-38, MRC-5, 2BS等。 WI-38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系 传代细胞在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处, 有时是从肿瘤细胞衍生而来, 由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性, 因而数十年间未允许传代细胞用于生产。70年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性 现在CCL已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞系。;;;;;;仙台病毒融合法;聚乙二醇融合法;电融合法;（2）杂种细胞筛选;2.重组细胞的构建（基因工程细胞系）;;a.病毒载体;用杆状病毒进行蛋白质的高效表达;b. 质粒载体;（2）基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选;DNA-磷酸钙沉淀法;;电穿孔法;;筛选;营养缺陷型受体细胞;第四节、制药工业中常用的动物细胞;;;WI-38细胞;Vero细胞;BHK-21细胞;CHO细胞-最为常用的生产载体 ;Sf-9细胞;Namalwa细胞;SP2/0细胞;第三节 动物细胞的培养;二、动物细胞的培养条件;;三、动物细胞的培养基;;氨基酸;维生素;3.天然培养基(nature medium) 动物体液或组织提取成分做培养液 血清最为常用 ：牛血清、马血清、兔血清 胎牛血清：取自剖腹产的胎牛；胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。 新生牛血清：取自出生24 h之内的新生牛； 小牛血清：取自出生10-30 d的小牛 维持液 生长液;;四、动物细胞的基本技术;;;（二）细胞的传代培养;（三）细胞的克隆培养;第五节 细胞的大规模培养;（一）动物细胞的大规模培养方法;;;商业化微载体;;;;培养筒内由数千根中空纤维所组成，封存在特制的圆筒里。圆筒内形成2个空间：每根纤维的管内为“内室”，灌流无血清培养液供细胞生长,管与管之间的间隙为“外室”。 接种的细胞贴附“外室” 管壁上，并吸取从“内室”渗透出来的养分生长繁殖。 培养液中的血清也输入到外室，由于血清和细胞分泌产物如单抗的分子质量大而无法穿透到内室去，只能留在外室并且不断被浓缩。 ;当需要收集这些产物时，只要把管与管之间的“外室”总出口打开，产物就能流出来。细胞生长繁殖过程中的代谢废物，因为都属小分子物质，可以从管壁渗进“内室”,最后从“内室”总出口排出,不会对“外室”细胞产生毒害作用。 一般细胞在接种1～3周后，就可以完全充满管壁的空隙。细胞厚度最终可达10层之多。细胞停止增殖后，仍可以维持其高水平代谢和分泌功能，长达几个星期甚至几个月。 ;（二）动物细胞生物反应器;85;;笼式通气搅拌器的改进-- NBS装置;⒉气升式生物反应器;气升式细胞培养反应器不仅在植物细胞培养中应用广泛,而且在动物细胞培养中也取得了很大的成功。;⒊中空纤维式生物反应器;⒋透析袋或膜式生物反应器;;CellGen plus生物反应器;6.一次性摇袋细胞培养反应器;三、动物细胞大规模培养的操作方式;国内外动物细胞生物反应器现状;四军大采用5L CelliGen反应器连续灌注培养杂交瘤细胞，培养第9天细胞密度达到8×106/ml以上 目前国内未见有万升级的生物反应器用于生产的报道 同时我国有关商品化大规模动物细胞反应器产品还处于空白，有待于进一步改进现有生物反应器，设计或设计新型的生物反应器。 目前，百泰药业的哺乳动物细胞培养生产线，是目前中国规模最大、设施最完备、技术最先进的大规模细胞培养技术平台(08年开始有产品，灌流规模1000L（实际750L），正在建2500L，预期建成后年生产能力将达到4