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比色法测定知母总皂苷含量 【摘要】 目的建立测定知母提取物中甾体皂苷含量比色方法。 方法用茴香醛硫酸溶液做显色体系，测定波长430nm，确定了最佳实验条件。结果标准曲线在25～150μg线性关系良好，相关系数0.999 8，平均回收率98.2%(RSD=3.18%)。结论该方法稳定性和重复性较好，可用于知母提取物甾体皂苷类物质纯度检查。 【关键词】 知母； 比色法； 甾体皂苷； 茴香醛 　知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎,性寒，味苦甘，具有清热泻火、生津润燥之功效，用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、内热消渴、肠燥便秘［1］。知母甾体皂苷是主要有效成分之一。药理研究表明，知母甾体皂苷具有“抗血小板聚集作用”［2］“上调脑M2受体及总M受体”［3］“对β受体调整作用”［4］“降低心率”“降血压”“对心肌缺血/复灌注损伤的保护作用”［5］“降血糖”［6］等作用。目前，测定知母总皂苷的方法主要有比色法。本文采用比色法，对不同显色体系进行了考察，测定知母皂苷提取物中的皂苷类物质含量，为知母提取物的质量控制研究提供 参考 依据。 　 　1 仪器与材料 　　TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京通用），香草醛（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）、茴香醛（对甲氧基苯甲醛）、对二甲氨基苯甲醛、无水乙醇、甲醇、硫酸等均为AR.级。知母皂苷A对照品（上海第二军医大学药学系提供，高效液相归一化方法测纯度为97.2%） 知母药材提取物，共9个批号（060512，060515，060521，060622，060728，060808，060816，060908，060928），本试验室自行提取分离。 　 　2 方法与结果 　　2.1 对照品溶液精密称取知母皂苷A对照品适量,加甲醇溶解并制成每毫升约含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。 　　2.2 供试样品溶液精密称取知母提取物粉末100 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每毫升约含2 mg的溶液，作为供试品溶液。 　　2.3 显色剂的选择为考察最佳显色剂，参考 文献 报道［7］，考察了香草醛、茴香醛、对二甲氨基苯甲醛等显色剂的显色效果和稳定性，配制方法和用量分别为： 　　A：1%香草醛无水乙醇溶液1 ml+硫酸-无水乙醇（7→10）1 ml； 　　B：0.5%茴香醛硫酸溶液0.5 ml（0.1ml茴香醛+1 ml硫酸+18.9 ml无水乙醇）； 　　C：0.35mol/L对二甲氨基苯甲醛水溶液1ml＋ 0.08 mol/L盐酸乙醇1 ml； 　　方法：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各100 μl，置10 ml具塞试管中，挥干溶剂，取出，分别按上述方法加入不同的显色剂，振摇均匀后，置100水浴中加热5 min，取出，立即置冰水浴中放置5 min，各管精密加入无水甲醇10 ml，摇匀，分别以各显色试剂同样操作管为空白，照分光光度法（《 中国 药典》2005年版部附录A）进行扫描，测定最大吸收波长处的吸收度。每隔5 min测定一次，观察30 min内吸收度的稳定性。结果见表1。表1 几种显色剂的显色效果及稳定性（略） 　　结果表明，香草醛为显色剂时稳定性较差，对二甲氨基苯甲醛不显色，故选择以茴香醛作为显色剂，并进一步考察各种因素对显色的影响。 　　2.4 显色温度的影响精密吸取8份对照品溶液100 μl，至具塞试管中，挥干溶剂，取出，分别加0.5%茴香醛硫酸溶液0.5 ml,各取2份分别在25，60，80和100下反应15 min，取出，立即置冰水浴中放置5 min，精密加入无水甲醇10 ml，摇匀，分别以各温度下的试剂管为空白，测定最大吸收波长和吸光度。结果表明，反应温度对最大吸收波长无影响，均在430 nm和504 nm波长处有最大吸收，但随着温度升高，430 nm处吸收度下降，504 nm处吸收度升高，而在100条件下吸收度最高，较为灵敏，故选择反应温度为100，测定波长430 nm。 　　2.5 显色时间的影响精密吸取6份对照品溶液100 μl，在反应温度100条件下，考察了反应时间5，10，15 min对吸收度的影响，以及吸收度的稳定性。结果见表2。结果表明，100反应5 min的吸收度较高，30 min内的稳定性较好，故选择100条件下，反应时间5 min为宜。表2 反应时间对显色的影响及稳定性（略） 　　2.6 线性范围考察分别精密吸取对照品溶液50，100，150，200，250，300 μl，至具塞试管中，挥干溶剂，取出，分别加0.5%茴香醛硫酸溶液0.5 ml,在100水浴中反应5 min，取出，立即置冰水浴中放置5 min，精密加入无水甲醇10 ml，摇匀，以