溶血卵磷酯对内皮细胞CD73的调节作用.docVIP

溶血卵磷酯对内皮细胞CD73的调节作用 【关键词】 腺苷 内皮细胞 胞外5核苷酸酶 　　1材料和 方法 　　1.1材料 　　细胞培养皿、培养液及细胞柱购自Promocell公司；试验所用试剂乙烯单磷酸腺苷（eAMP）、溶血卵磷脂（LPC）、白屈菜赤碱、AOPCP (α β甲基腺苷5二磷酸)、NBTI (n硝基苄基硫代次黄嘌呤核苷)购自 Sigma 公司. 　　1.2方法方法 　　分离培养PAEC, 所得第三代PAEC用于实验. 采用Deussen等［1］ 首先描述的细胞柱方法， 分析 测量PAEC的腺苷分泌. 本文进行两组实验，每组采用10个细胞柱. 每3 min持续收集一管流出液，每组观察对象收集5管流出液. 一组细胞柱中先后泵入eAMP（5 μmol/L），腺苷膜转运抑制剂（NBTI，1 μmol/L）， LPC(25 μmol/L） 及胞外5外核苷酸酶抑制剂（AOPCP，50 μmol/L）. 另一组细胞柱按顺序泵入以下试剂：eAMP（5 μmol/L），NBTI（1 μmol/L），蛋白激酶C（PKC）抑制剂白屈菜赤碱(100 μmol/L），LPC(25 μmol/L）. 应用 高性能液相色谱仪(HPLC)测定腺苷及乙烯腺苷含量. 提取细胞柱中所有的PAEC，以Lowry 等［２］所描述的方法测定其蛋白含量. 　　2结果 　　两组细胞柱在仅泵入eAMP时细胞柱中PAEC合成产生内源性腺苷(5.0±1.8) pmol/ min﹒mg-1. NBTI使此值显著升高至(9.7±3.9) pmol/ min·mg-1 (P0.001,vs 对照). 第一组细胞柱在泵入 LPC时，此值进一步显著升高至(103.5±36.3) pmol/ min·mg-1 (P0.001,vs NBTI时). AOPCP使其显著下降至(2.5 ±1.1) pmol/ min·mg-1 (P=0.001,vs LPC时). 同时测得eAMP转换生成eAD的比率在对照情况下为32.7％±16.1%，注入NBTI后，此比率为34.1％±13.2 %,与对照差别无统计学意义（P0.05,vs 对照）. 当泵入LPC后，此比率显著升高至67.2％±12.0% (P0.001, vs NBTI时). AOPCP使此比率显著下降至2.3％±2.1% (P0.001, vs LPC时).在另一组细胞柱中，在泵入PKC酶抑制剂白屈菜赤碱后再泵入LPC时,PAEC自身合成腺苷为(15.6 ±7.3) pmol/ min·mg-1,与其前仅泵入NBTI时差别无统计学意义（P0.05，vs NBTI时）.此时eAMP转换生成eAD比率为35.0%±2.8%,与前一情况下相比差别亦无统计学意义（P0.05，vs NBTI时）. 　　3讨论 　　近年来有 研究 表明腺苷参与缺血预适应及后适应，有极强的心脏保护作用［3］，从而使体内腺苷的分泌及其调节受到人们广泛的关注. 然而由于腺苷可经细胞膜在细胞内外之间转运，且在细胞内迅速代谢，难以准确测定细胞外腺苷合成变化，故关于胞外腺苷分泌及CD73活性调节的数据较少. 本研究采用AMP及腺苷的相似化合物eAMP对CD73活性进行观察. 结果显示，NBTI抑制腺苷的膜转运后，腺苷分泌率较生理情况下升高近一倍，表明生理状态下，细胞外生成的腺苷近一半被转运入细胞. 其原因可能为细胞内腺苷快速代谢，造成细胞内外腺苷浓度阶差，使细胞外腺苷顺此阶差转入细胞内. 此结果与本研究小组对人脐静脉内皮细胞的研究结果一致［4］. 而泵入NBTI后eAMP转换生成eAD的比率与模拟生理情况下相比无改变，表明eAMP及由其经CD73转换生成的乙烯腺苷不能转运入细胞膜，注入eAMP后测定生成的乙烯腺苷可很好地反映CD73的活性. 给予PKC兴奋剂LPC，使PAEC合成内源性腺苷及eAMP转换生成eAD的比率均显著增加，表明LPC可以兴奋CD73，显著增加细胞外腺苷分泌. 本研究在10个细胞柱试验中以白屈菜赤碱抑制PKC后，再观察LPC对CD73活性的 影响 . 结果显示此时LPC对CD73的兴奋作用被消除，PAEC自身腺苷分泌率及eAMP转换生成eAD的比率与泵入LPC前无显著变化. 从而进一步证明LPC兴奋CD73的作用是通过PKC而产生. 在泵入AOPCP使细胞的自身腺苷分泌率及eAMP生成eAD的转换率显著降低，进一步证明细胞外腺苷是经CD73合成的. 　　通过本实验，我们得出以下结论：（1）PAEC腺苷细胞内代谢非常迅速，从而使生理状态下腺苷由细胞外转入细胞内；（2）LPC可兴奋PAEC细胞外5核苷酸酶，增加腺苷分泌；（3）LPC兴奋CD73的作用与PKC有关. 【 参考 文献 】 　　［1］Deussen A, Bading B, K