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肝糖原的提取,定性以及定量实验课案
生物化学实验报告
姓 名: 张子荣
学 号: 3150901080
专业年级: 2015级临床医学
组 别: 第五实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称 实验日期 实验地点 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 小四号,宋体,1.5倍行距数字、英文用Times New Roman;实验目的实验原理CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2
2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O
2CuOH = H20 + Cu2O (红色)
Cu(OH)2 ==== H2O + CuO (黑色)
3.肝糖原的定量
糖原在浓酸中可水解为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10—100mg范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其他成分,而保留肝糖原。
三、材料与方法以流程图示意鸡肝约1 g,剪碎
+5%CCl3COOH 1 ml
研磨至乳状
+5%CCl3COOH 3 ml
研磨成肝匀浆
全部转入离心管中,离心3分钟(4000 r / min)
沉淀(弃去) 上清(取ml)
+95%乙醇,混匀,静置10分钟
离心5分钟(4000 r / min)
上清(弃去) 沉淀
+蒸镏水1 ml
沸水浴2分钟,溶解沉淀
白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml
+浓HCl 5滴
加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 沸水浴15分钟,冷却
糖原溶液2滴 +50%NaOH 5滴
呈色对比 糖原水解液2滴糖原水解液
+班氏试剂4滴
混匀
沸水浴2分钟,观察变化
沸水浴15min
冷却,全部转入100ml容量瓶中
加水至标线,仔细混匀,获得糖原提取液
取3支干净的试管,按下表操作:
试剂(ml) 空白管 标准管 样品管 蒸馏水 1.0 —— —— 标准葡萄糖溶液 —— 1.0 —— 糖原提取液 —— —— 1.0 0.2%蒽酮溶液 2.5 2.5 2.5
混匀,沸水浴10min,冷却。在722型或721型分光光度计620nm波长处,用空
白管溶液调零,测定各管溶液的吸光度(A).计算:
肝糖原(g/100g肝组织)= X 0.05 X X X 1.11
注:由于我们组样品是稀释2倍的,所以后来结果要X稀释倍数
四、结果与讨论①结果:实验数据、现象、图谱;②讨论:以结果为基础的逻辑推论,并得出结论。≈ 8.675(g/100g)
分析以及结果讨论:
1.在鸡肝糖原的定性分析中,即
①呈色反应中,样品溶液加入碘试剂后呈现明显的红褐色,说明样品液含有糖原;
②在样品液水解液与班氏试剂反应中,使溶液呈现砖红色;说明水解液含有葡萄糖(还原性糖)
综上,鸡肝中含有丰富的糖原。
2.在鸡肝糖原的定量实验中,我们组所得的肝糖原含量实验数据为8.675g/100g,而正常情况下为2-3g/100g,明显偏高。但在操作过程中称量0.15g鸡肝,加入KOH,水浴,加入蒽酮(换用加样枪结果依旧)均不存在操作问题,所以造成此结果的原因可能是:
①实验所用的鸡处于饱食状态,糖原大量储存缓解血糖浓度,因此使肝中的糖原明显多于一般情况下的鸡糖原含量;
②试剂误差:实验所用的试管可能由于上一组没有清洗干净,造成了部分糖原残留在试管导致我们组的结果偏高;另外,100ml容量瓶中含有少量白色固体难以清洗干净,也有可能是上一组留下的糖原未清洗干净。所以致使糖原测得值较高;
糖原试剂组
对照组,2滴碘试剂
+30% KOH 1.5ml
不分层的橘黄色溶液
不溶性杂质等物质
溶液
脂肪等物质
鸡肝漂浮物
沉淀
上清液
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