乙肝两对半检测中(南京)资料.pptVIP

乙肝两对半免疫学检测相关问题研讨 　　　　　中山三院检验科　李林 HBV感染的实验室检测是目前国内最为常见的检验项目，也是医患纠纷产生较多的领域之一。 卫生部临床检验中心 李金明 乙肝两对半： 　HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。 检测结果：定性、半定量、定量。 试剂原材料：抗原（天然抗原、重组抗原）、抗 　体（单抗、多抗、Fab）。 检测技术： 　ELISA、化学发光、时间分辨荧光、免疫层析等。 检测方法：夹心法（一步法，两步法），竞争法（固相－液相竞争法，液相－液相竞争法等）。  一、HBsAg 方法：双抗体夹心法：两步法，一步法。 试剂原材料： HBsAb（ McAb、 PcAb）或其酶解产物 Fab 。 HBsAg抗原表位 1、共同决定簇： a（ aa124-147）； 2、型特异决定簇： （1） d/y（ aa122，赖氨酸/精氨酸）； （2） w/r（ aa160，赖氨酸/精氨酸）； 四种亚型：adr、adw、ayr、ayw。 检测中常见的问题 1、一步法测定中的钩状效应（Hook effect）： 双抗体夹心一步法的钩状效应（示意图）: 钩状效应时分析浓度与检测信号关系图： HBsAg检测试剂原材料与钩状反应的关系： 原材料：HBsAb。 多克隆抗体：免疫动物或直接从感染者血清中所获得，来源于不同的B细胞克隆，可含有针对同一抗原分子不同的抗原表位（a、 d/y、 w/r）的多种定向抗体。 单克隆抗体：由一株B细胞杂交瘤产生的只针对某一特定的抗原表位的高度均一，高度专一性的抗体。 McAb制备的试剂受钩状效应的影响较PcAb为轻： 　　Ig的一个Fab片段只能与一个抗原表位结合。McAb为针 对同一抗原表位的均一抗体分子群。 HBsAg分子虽具有三个 不同的表位(a、d/y、r/w)，但一分子HBsAg同样的表位只有 一个，只能封闭一个单体McAb的一个抗原位点，两分子抗 原才能封闭一个McAb单体。而PcAb为针对同一抗原不同表 位抗体分子群(抗a、抗d/y、抗w/r )，一分子HBsAg上不同的 表位可同时与针对不同表位的两个以上单体PcAb结合，其封 闭作用的效率高于对McAb。 McAb试剂的钩状效应 PcAb试剂的钩状效应 钩状效应是HBsAg一步法检测时不可避免的现象； 由于钩状效应的存在，一步法检测HBsAg所得到的检测信号无法确定其真实性； 解决勾状效应的根本方法为固相抗体与抗原反应后分离游离抗原，再加标记抗体的两步法检测： 　第一步：包被抗体捕获抗原成为固相，然后分离游离抗原；第二步：固相抗原与标记抗体结合，分离液相标记抗体后记录检测信号。 　两步法检测： 　 两步法检测时目的检测物浓度和检测信号关系曲线 易误解为两步法的一步法检测： 1、标本＋生物素化抗体＋标记抗体　　生物素化抗体－抗原－标记抗体复合物； 2、加入亲和素包被的固相载体　　固相生物素化抗体－抗原－标记抗体复物； 3、洗涤，判读结果。 2）人抗鼠抗体效应(Human anti-mouse effect, HAMA效应) 对检测的干扰 HAMA效应的假阳性模式：标本中的人抗鼠抗体分别与固相HBsAb和标记HBsAb McAb结合，形成固相HBsAb－HAMA－HBsAb复合物（双抗原夹心），提供假阳性检测信号。 Human Anti-Mouse Antibodies (HAMA) HAMA效应的假阴性模式: 3) S基因突变引起的HBsAg漏检： 基因突变引起“a”决定簇内部一个或多个 氨基酸置换、缺失或插入，HBsAg 蛋白质氨 基酸组成发生改变，导致其抗原性产生变化。 变异率高 ，自然变异和免疫逃避，变异无 地域性。 HBsAg抗原性发生改变，不能被野生型 HBsAb所识别。 此时用一般的国产试剂盒可能 检不出。 能导致HBsAg阴性的S区变异 145甘氨酸 精氨酸 aa124 半胱氨酸 酪氨酸 aa129 谷氨酸 天冬氨酸 aa131 苏氨酸 天冬氨酸 aa131 蛋氨酸 苏氨酸 aa122-124 插入氨基酸 前S1/S2部分缺失 不一定HBsAg抗原性发生改变后就一定漏检。很多时候野生型与突变型是混合存在的，这种情况虽然有突变，同样可以检出 。 4)RF引起的假阳性 RF是一种自身抗体，能和多种动物IgG的Fc段结合。由于固相抗体和标记抗体均为IgG，双抗体夹心法测抗原可能有RF的干扰