蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定课案.doc

本 科 毕 业 论 文 蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定 专业名称：生 物 科 学 1302 学生姓名： 贾 旭 学 号： 2013044020206 导 师： 韩 军 蛋白酶高产菌株的选育以及菌种鉴定 摘 要 分离和纯化培养法在实验中常常是分离杂菌筛选所需菌落的有效方法，紫外线诱变可以试验出菌落突变率最高的诱变时间或诱变强度，从而选择最适剂量对纯化菌株进行诱变，产生性能更加优秀的可育后代，这就是菌株的选育过程。本实验采用以上方法对土壤中的杂菌进行分离纯化，得到纯化的能分解蛋白质的菌株，通过紫外线诱变而获得分解能力强的菌株，即高产蛋白酶的菌株。菌种鉴定则是对微生物快速深入了解的捷径。 关 键 字 灭菌、培养基、无菌操作、分离纯化、紫外线诱变、菌种鉴定 Abstract 英文省略。 正 文 1.蛋白酶菌种的采样 由于采样的菌种需要有分解蛋白质的能力，所以采样地点可以是餐饮聚集地或者种植大豆等富含高蛋白植物的土地。 2.蛋白酶菌种的分离纯化 2.1.实验用品的灭菌 灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类.本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌. 加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种.通过加热使菌体内蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的.蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低.在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,因为在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强,可增加灭菌效力.本实验采用高压蒸汽灭菌法。 2.1.1.灭菌前的准备 玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞,以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染.常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸,用棉绳以活结扎紧,以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心,轻轻捅入管口,松紧必须适中,管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去,灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌,也可用纸条斜着从吸管尖端包起,逐步向上卷,头端的纸卷捏扁并拧几下,再将包好的吸管集中灭菌. 2.1.2.高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是微生物学实验中最常用的灭菌方法.这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的.当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时,水蒸气的温度升高到121℃,经15～30min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢.一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。 2.1.3火焰灭菌 直接用火焰灼烧灭菌,迅速彻底.对于接种环,接种针或其它金属用具,可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌.此外,在接种过程中,试管或三角瓶口,也采用通过火焰而达到灭菌的目的. 2.1.3.操作方法和注意事项 加水：打开灭菌锅盖,向锅内加水到水位线.立式消毒锅最好用已煮开过的水,以便减少水垢在锅内的积存.注意水要加够,防止灭菌过程中干锅. 装料、加盖：灭菌材料放好后,关闭灭菌器盖,采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋,使蒸汽锅密闭,勿使漏气. 排气：打开排气口(也叫放气阀).用电炉加热,待水煮沸后,水蒸气和空气一起从排气孔排出,当有大量蒸汽排出时,维持5min,使锅内冷空气完全排净. 升压、保压和降压：当锅内冷空气排净时,即可关闭排气阀,压力开始上升.当压力上升至所需压力时,控制电压以维持恒温,并开始计算灭菌时间,待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃,20min）后,停止加热,待压力降至接近“0”时,打开放气阀.注意不能过早过急地排气,否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外. 灭菌后的培养基空白培养：灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养,经24h培养无菌生长,可保存备用；斜面培养基取出后,立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后,空白培养. 2.2菌液的配置 准备10支试管，第一支加入10mL蒸馏水，其余加入9mL并编号1~10。将采样的土壤取1g放入到装有10mL蒸馏水的试管中，依次在前边一个试管中取1mL加入后一试管中做梯度稀释，直到最后一试管。（每次做梯度稀释时都要将前一个试管中的菌液混匀） 2.3.培养基的配置 2.3.1.培养基的原理 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料.由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之实验和研究的目的不同,所以培养基的种类很多,使用的原料也各有差异,但从营养角度分析,培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等.另外,培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧