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常见分子操作基本步骤 1、总RNA的提取（BIOZOL法提取） 1 2、植物种胚中RNA的提取（CTAB - LiCl 提取法） 3 3、两步法RT-PCR 4 4、琼脂糖核酸电泳 7 5、胶回收纯化DNA （AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒） 9 6、连接（T载体连接） 11 7、连接（T4 酶连） 12 8、感受态细胞的制备（大肠杆菌） 13 9、质粒DNA的提取（碱裂解法） 15 10、酶切 16 11、Ni柱纯化His-tag蛋白质 17 11.1 非变性条件下抽提His-Tag蛋白质 17 11.2 变性条件下从包涵体中纯化His-Tag的蛋白质 21 12、NTA树脂的再生 23 1、总RNA的提取（ZOL法提取）nase外，环境中也存在大量Rnase。外源性的Rnase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的Rnase也会造成污染。这些外源性的Rnase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的Rnase。 因此在提取RNA时，应尽量创造一个无Rnase的环境，包括去除外源性Rnase污染和抑制内源性Rnase活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性Rnase，通过Rnase的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性Rnase（注：BIOZOL溶液包含异硫氰酸胍和苯酚，实验时请格外小心）。 在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于80 °C冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1）提取组织RNA，研磨的研磨液氮EP管2）用液氮将上述组织研磨转入EP管中每50～100 mg组织用1 ml ZOL试剂对组织进行裂解在室温15~30 °C下放置5分钟； 3）在上述EP管中，按照每1 ml ZOL加0.2 ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15 °C～30 °C）放置2～3分钟后，12000g（2 °C～8 °C）离心15分钟； 4）取上层水相置于新EP管中加入异丙醇每1 ml ZOL约加0.ml异丙醇，0 °C放置10分钟2000g（2 °C～8 °C）离心10分钟； 5）弃上清，加1 ml 75 %乙醇进行洗涤，混合，7500g（2 °C～8 °C）离心5分钟，弃上清； 6）让沉淀的RNA在室温下自然干燥； 7）用Rnase-free water溶解RNA沉淀。在1. 5 ml EP管中加入700 μL的RNA提取液2 % CTAB (w/v)，内含2 %～5 % PVP (wv)，100 mmol/L Tris - HCl（pH8 . 0），25 mmol/L EDTA（pH8 . 0）和mol/L NaCl，灭菌使用前加入β-巯基乙醇使其终浓度为2 %～5 % (vv) ），并置于65 °C水浴锅中温育h以上灭菌镊子剥取的水稻种胚直接加入RNA提取液灭菌玻璃棒捣碎涡旋混合继续在65 °C温育10 min 加入等体积的氯仿异戊醇涡旋混匀后4 °C 10000g离心10 min用灭菌小心剔除漂浮的脂肪层吸取上清重复上述步骤并在合并的上清中加入体积的10 molL LiCl 溶液并混匀4 °C条件下过夜使RNA沉淀次日于4 °C10000 rpm 离心20 min弃上清用Rnase-free water溶解RNA再加入体积3 molL的NaAc和体积9 %乙醇置于- 0 °C环境下30min 使RNA沉淀4 °C，10000 rpm再次离心20 min弃上清最后用70 %的乙醇清洗沉淀吹干后用Rnase-free water溶解RNA保存于- 0 °C冰箱中备用。°C 5 min，立即冰水浴，稍离心，以去除二级结构。 Reagent（反应物） Quantity, for 20μl of reaction mixture Oligo (dT) 1 μl 10 mM dNTP mix 2 μl RNase Free dH2O 5 μl 实验样品RNA（1 μg） μl Total 10 μl /Sample （2）°C 2 h，最后95 °C 10min（使AMV变性），混匀离心后-20 °C保存。 Reagent Quantity, for 20μl of reaction mixture 5 × AMV buffer 4 μl AMV 0.5 μl RNase Free dH2O 5.5 μl Total 20 μl /Sample 第二步：PCR反应 （1）按下列组成在PC