松材线虫、松墨天牛和松树间的共生关系.doc

得分：_______ 南 京 林 业 大 学 研究生课程论文 2015 ～20016 学年 第二学期 课 程 号： 课程名称： 论文题目： 学科专业： 森林保护 学 号： 3150462 姓 名： 王立超 任课教师： 黄麟 二○一六 年 六 月 内容 本文研究松材线虫、松墨天牛和真菌在松树中的共生关系 实验材料和方法： （1）真菌 小长喙霉在PDA平板上、25℃条件下培养一周，使用前在5℃条件下保存。 灰葡萄孢在10 mL的大麦籽粒上培养。 （2）线虫 强毒虫株松材线虫T-4在25℃条件下在灰葡萄孢上培养，使用前在5℃条件下保存。松材线虫悬浊液包括成虫和幼虫，悬浊液浓度为50000条/mL。 （3）昆虫 松墨天牛在恒定条件下培养（25℃，16h光照、8h黑暗），让其繁殖10代，第七代到第十代成虫用来在赤松小苗上产卵，收集天牛所产的卵并将其放置在湿纸巾上，在一天之内孵化的幼虫用于实验。 （4）松枝 2014年六月采伐两颗12年生（胸径分别为3.9和5.2cm）的赤松和两颗12年生的黑松（胸径分别为8.1和9.0cm），分别在实验1和实验3中使用。2015年二月采伐3颗12年生的赤松用于实验2，胸径分别为7.4、7.6和8.4cm，2014年十月采伐一颗12年生的赤松用于实验4，其胸径为6.8cm。树枝截为15cm一段，在树枝的两端用石蜡密封起来，每个实验组树枝的树木特定的每组树枝之间不存在显著差异 (5)接种 使用凿子和镊子在离树端13.7mm处从木质部分离树皮（面积22.3mm×17.3mm），用刻刀在漏出的木质部中间挖一个直径6-7mm圆形刻槽用以放置松墨天牛幼虫，一份带有灰葡萄孢或则没有灰葡萄孢的面积为5×5mm的PDA培养基放置在远离树端、接近圆形刻槽的位置。用到划长16.8mm、最大宽度为14.3mm的三角形裂口，在漏出的韧皮部接种20uL的线虫悬浊液（1000条线虫）或者是无菌纯净水。两个树皮伤口最小距离平均为13.7mm，两个伤口接种后覆盖原来的树皮，用封口膜包起来，即使不接种松墨天牛幼虫，也挖一个小刻槽，实验4中松树枝条不用接种松材线虫悬液或水，不会在树皮上形成倾斜伤口。 实验一、 为了确定松墨天牛幼虫和小长喙霉对松材线虫种群生长的影响，一组赤松枝条接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉。第二组枝条接种松材线虫、松墨天牛和PDA，第三组枝条接种松材线虫和小喙长霉，第四组枝条接种松材线虫和PDA。他们被垂直放置使线虫远离容器底部。25℃，16h光照、8h黑暗，相对湿度100%条件下常温培养，用纯净水保持湿度。 接种18天后，从松枝上剥离树皮，从枝条上取幼虫和幼虫粪便，记录韧皮部和木质部上蓝变面积确定小喙长霉的繁殖情况，从纵向韧皮部上剥离四份之一到二分之一的树皮，将树皮外层剥离，收集里面树皮以获得韧皮部样品，再将里层树皮的韧皮部剪切为1-2mm大小的树皮块，使用一把15mm宽的刀片，从接种松墨天牛幼苗和松材线虫的地方包括髓取木质部样品，记录木质部样品真菌繁殖情况，粪便、韧皮部和木质部分别在25℃下使用贝尔曼漏斗法分离48-72h，计算分离线虫浓度，材料在60℃下烘5-12d，称重，线虫密度表示每克材料干重中松材线虫的数量。 分别使用电子天平和游标卡尺测量幼虫体重和头壳宽度，分别精确到0.1mg和0.05mm，根据头壳宽度确定幼虫龄期：0.585–1.170,1.260–1.935, 1.980–3.150和3.150–4.365 mm分别为一龄、二龄、三龄和四龄虫。 实验二、 确定赤松中韧皮部、木质部和天牛幼虫蛀屑线虫密度的不同，在2015年2月26日将刚孵化的幼虫、1000条松材线虫和一份接有小长喙霉的PDA接种在10条直径相似的上述赤松枝条上，2015年3月26日分别将韧皮部、木质部和幼虫蛀屑用以分离线虫，确定线虫密度， 实验三、 确定松材线虫种群和小喙长霉对松墨天牛生长发育的影响，四组黑松枝条接种松材线虫、松墨天牛和小喙长霉三个物种组成的四种组合。方法和实验一方法相同，培养条件相同。 每天观察松枝，记录松墨天牛羽化情况，分性别记录成虫数量，体重和鞘翅长分别精确到0.1mg和0.05mm。没有松墨天牛出现的松枝在接种153-164d后分离，称量幼虫的鲜重和记录头宽、颜色、肠内排泄物的有无以及幼虫所在的位置。 实验四、 为确定松墨天牛幼虫对小喙长霉繁殖的影响，6个赤松枝条接种小喙长霉和松墨天牛幼虫，接种22d后，剥离松枝树皮，幼虫蛀屑和幼虫取样，测量幼虫体重和头壳宽度 文章结构 摘要 关键词 前言 材料与方法 真菌 线虫