分子生物学常用技术4DNA测序和基因芯片.pptxVIP

分子生物学常用技术 ; 核酸的序列分析，即核酸一级结构的测定，是现代分子生物学中一项重要技术。目前常用的两种序列测定技术是： Sanger等（1977年）：双脱氧链终止法 Maxam和Gilbert（1977年）：化学降解法 其中双脱氧链终止法是目前应用最多，易自动化。; BAC算法: 建立BAC文库：把基因组打碎成200－300kb的片段，并制成BAC文库，再选择一些BAC进一步打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接。WGS:全称为whole-genome shotgun， 基因组直接打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接。并且，WGS在现在的测序项目中使用得越来越广泛。例如水稻基因的测序，就是使用的WGS策略。 ;F.Frederick Sanger(1918～) 剑桥大学教授。 1943年以研究赖氨酸的课题获博士学位 1955年测定了胰岛素的一级结构 获1958年诺贝尔化学奖。Sanger经过多年的研究，找到一种试剂，名为2，4－二硝基氟化苯（桑格试剂），经10年的努力，测定出胰岛素两条肽链分别含21个和30个氨基酸的排列顺序和位置， 60年代后，Sanger的工作转向核酸方面，正确地确定了RNA和DNA中核苷酸的排列顺序。  Sanger因设计出一种测定 DNA内核苷酸排列顺序的方法而与W.吉尔伯特 共获1980年诺贝尔化学奖。即双脱氧法测序（DNA自动测序仪以本原理设计） 1982年Frederick Sanger退休 Sanger研究所和德国的Epigenomics AG公司将联手进行人类外基因组计划(Human Epigenome Project)。;Sanger双脱氧链终止法原理;一、Sanger双脱氧链终止法原理 通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。 如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），因为它与普通dNTP不同，在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。 ;; 存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP（其中一种为α-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5-引物端和以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱, 将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。 ; 采用类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。 ;ddATP;全自动测序技术;二. 测序过程: 1.模板制备:克隆 DNA, PCR产物, 细菌克隆, genomic DNA 2.引物设计: 通用 primer m13, T7, sp6 et al ; specific primer 3.引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物 终止剂不同 ddATP ddGTP ddCTP ddTTP 标记4种荧光 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 4.电泳 ACGT次序 高压电泳 5.显影得到直读图象;ABI PRISM310 全自动测序仪;人类基因组计划的概述;人类基因组研究的策略  （1）建立插入人类基因组片段的酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC 200－1 000kb）克隆群。几十到几百kb的细菌人工染色体克隆（BAC）　　 （2）利用DNA标志或者DNA指纹图谱建立克隆之间的联系，组成有序排列的连续克隆系，建重叠度最低的连续克隆系　　 （3）将克隆群定位于染色体的不同区域，构成完全基因组物理图谱。  （4）进行次级克隆，序列分析。　　;人类基因组计划三次宣布完成; 人类基因组就是指人体细胞中的24条不同的染色体，即1—22号常染色体、X和Y染色体所带有的遗传信息的总和。 每个染色体为一个脱氧核糖