总RNA的提取和RT-PCR.ppt

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动. DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 琼脂糖凝胶电泳原理 影响迁移速率因素 1、 DNA的分子大小 2、 琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象 4、 电源电压 5、 嵌入染料的存在 6、 离子强度影响 琼脂糖凝胶电泳原理 实验材料 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 染料：Gelview、EB 电泳缓冲液：TBE 琼脂糖 DNA Marker 5000 含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测目的基因片段大小。 应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。 DNA Marker 实验材料 凝胶准备 胶床准备 铺胶 静置 胶床置于电泳槽中 加电泳缓冲液 拔梳子 上样 电泳 取出凝胶 拍照 实验步骤 本实验所扩增的产物DNA片段长度400bp～500bp, 可取5?l PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准DNA marker评估扩增的特异性。 琼脂糖凝胶电泳 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使制板变形 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔 电泳前，确认样品孔位于电场负极； 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 Gelview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 紫外线照射不要太久 注意事项 OD值(optical density)表示某一物质在某一个特定波长下的吸光度. 在分析化学里,某一化学物质都可吸收一定波长的光,并且对光的吸收度与这样化学物质的浓度成正比.因此可以利用吸光度的大小来测定某种物质的浓度. * * * 核酸为两性分子,在pH3.5时，整个分子带正电,pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 * * 总RNA的提取、定量与RT-PCR 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程 目 的 实 验 流 程 提取原理 操作步骤 逆转录原理 操作步骤 提 取 总RNA 定 量 合成cDNA 第一链 原理体系 引物选择 PCR 电泳原理 电泳步骤 电 泳 计算方法 操作步骤 第一部分 细胞总RNA的提取及定量 原 理 10-5mg RNA/细胞 mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 目前常用的是Trizol法。 rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5% Trizol的主要成分 Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂 主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。 取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 原 理 所有RNA的提取过程中都有五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源RNA酶的有效抑制； 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 关 键 点 RNA酶污染来源 RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、