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第四章 肝炎诊断基因芯片的制备及性能研究 §4.1 前期研究与实验 从基因芯片技术实用化的角度来看，要求检测技术与芯片点阵结构相匹配。目前国际上通常采用激光诱导荧光检测，但氩离子激光源和检测设备系统庞大，且价格昂贵，这势必阻碍了DNA芯片的广泛应用。而化学发光检测方法抛弃了外部光源,更加简便,开始在DNA芯片领域得到应用。相比之下, 电化学检测方法直接以电信号作为检测信号,便于与集成电路实现系统集成,使检测系统微型化，是一种很有发展前途的DNA芯片检测技术。我们的前期研究拟在硅片上制备金电极微流路和探针点阵，利用金电极微流路导出探针分子与样品分子杂交后的电信号，经放大作为检测信号，使之便于系统集成，为后期的电化学检测生物芯片和芯片实验室研究做前期探索。 4.1.1 芯片版图设计与制备 根据试验和研究的需要，利用计算机辅助设计CAD（Computer-Aided Design）技术设计出芯片微流路版图，和芯片点阵版图。微流路版图就是芯片中的微型测试电极布局图；芯片点阵版图就是基因芯片的探针点阵布局图。然后再利用微电子加工技术制备微阵列流路和点阵。 1、版图设计 因为考虑到在硅片上制备微流路反应池，先要设计出微流路平面图，再根据实验条件（包括微电子加工工艺）设计出相应的光刻掩模版图，接着就是制备掩模版[1][2][3]。我们设计版图尺寸为20×20mm2，探针点的直径为80μm，探针点中心之间的距离为1000μm，防止不同探针之间的反应互相影响。金电极微流路图和探针点阵图分别如图4.1和图4.2所示。 2、微阵列的制备 微电子加工技术是指集成电路工艺中氧化、化学汽相淀积、蒸发溅射、光刻、腐蚀等一系列技术[4][5]。它在基因芯片技术中主要用于芯片方阵的构建，即微阵列的形成。下面就制备适于电化学检测的金电极微流路的DNA微阵列提出一系列试验方案，所有试验无特殊说明外，均在超净实验室进行。 ① 掩模版的制备 利用制版工艺技术，制备相应的超微粒干版[5]，即下面试验要用到的光刻掩模版——微流路掩模版和点阵掩模版，分别用于芯片的检测电极电路的构建和探针点阵的构建，在下面的试验中，称之为A版和B版。探针微阵列又分为许多功能小区，一个小区的局部示意图分别如图4.3，图4.4所示。 ② 利用氧化技术制备二氧化硅薄膜 先将硅片抛光，清洗，然后将洁净的硅片在1200℃下进行6小时氧化（1小时干氧，再4小时湿氧，接着再1小时干氧），在硅片表面生成一层致密的二氧化硅薄膜[5][6]。 ③ 第一次光刻，刻蚀掉要淀积微型测试金电极的那部分SiO2薄膜[4][5] 用A版和负性光刻胶（我们用的是聚乙烯醇肉桂酸脂），这种光刻胶的特点是光照后抗腐蚀。首先利用匀胶机将光刻胶均匀地涂在硅片光亮的那面（我们利用抛光后消除了很多缺陷和层错的平整光洁硅表面），在80℃左右烘干，覆盖掩模版，暴露在UV光下，光照部分的胶经过显影后被留下来，显影液为丁酮，然后在160℃下进行烘焙坚膜，改善胶膜与硅片间的粘附性，增强胶膜的抗腐蚀能力，接着在氢氟酸（HF）和氟化铵（NH4F）配成的腐蚀液中腐蚀，就可以刻蚀掉将要淀积金电极的那部分SiO2薄膜，最后用浓硫酸去胶，显露出洁净的微流路图形。 ④ 利用溅射技术淀积一层金薄膜 溅射是与气体辉光放电现象密切相关的一种薄膜淀积技术。在高真空室内充入氩气，气体在高电场作用下，形成高能量离子流，去轰击金靶，使金分子以高速溅射到硅片上，淀积成薄膜[5][6]。 ⑤ 第二次光刻，刻蚀出微流路金电极[4][5][6] 用A版和正性光刻胶（我们用的是30厘泊的BP－212），这种光刻胶的特点是不光照部分抗腐蚀。其程序与第一次光刻大致相同，只是其中所用的显影液和腐蚀液分别改为浓度为0.6％的氢氧化钠显影液和碘与碘化铵溶液配成的腐蚀液。再用浓度为40～50％的NaOH溶液去胶。 ⑥ 淀积一层氮化硅（Si3N4）薄膜 利用辉光放电法，在低真空（约0.1托）下，以硅烷（SiH4）与联氨（N2H4）作为反应气体，利用气体放电时产生的高温，促使气体发生化学反应生成氮化硅（Si3N4）淀积在硅片上[5]。 ⑦ 第三次光刻，利用干法等离子腐蚀刻蚀出点阵列[5][6] 用B版和负性光刻胶，程序与第一次光刻相同，只是最后一步腐蚀时，采用干法等离子腐蚀，利用氟利昂14（CF4）刻蚀掉没有被保护的氮化硅（Si3N4）薄膜，露出一个个金薄膜点阵列。单个点阵的局部剖面图如图4.5所示。 ⑧ 制备DNA微阵列（DNA探针）[7][8][9][10][11] 在点阵列上包被氨基硅烷或多聚赖氨酸，使其带上正电荷，以吸附带负电的碱基（A、G、C、T），合成时按照探针上预定的碱基种类，将芯片浸入该种类的碱基溶液中，每浸入一次，就增加一个碱基。同样是采用屏蔽掩模系统和光敏覆盖物，重复操作