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双荧光报告基因分析 实验目的： 研究转录因子的活性和调控元件的活性。 实验原理： 通过将感兴趣的目的基因转录调控元件构建到带荧光素酶（firefly luciferase）的表达载体，如pGL3，构建成报告基因质粒然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。为避免由于质粒转细胞时效率的差异而带来的误差，可以同时转入Renilla荧光素酶的报告基因质粒作为内参Renilla以及待研究的转录因子的表达质粒共转染细胞，并根据需要刺激或处理细胞，24h-48h后收细胞。在共转染时，由于内参质粒Renilla有很强的promoter/enhancer，因此报告基因质粒:Renilla转染量一般为10：1到50：1。 3．Luciferase活性的测定（以promega的双荧光报告试剂盒为例） 3.1 细胞裂解 试剂盒中提供的裂解液为5X PLB（passive lysis buffer），使用前取1体积的PLB，加4体积的dH2O混匀。去掉细胞培养液，用PBS洗一遍以去掉残留的培液，加入1X PLB。并将培养板于摇床上室温摇15min，使细胞充分裂解。将细胞裂解液转移至ep管，12000g X 30sX 4℃离心。上清中即含有firefly luciferas 和Renilla luciferase，用于测