NO2以潮霉素抗性为选择标记瘟病菌原生质体转化.pdf

维普资讯 7 ；Q 3fz 遗 传 学 报， 2l(4) ^ct口 Ge~ tice Stnica 以潮霉素抗性为选择标记的 稻瘟病菌原生质体转化④ ． 重盘兰 在金霞 邹 勤 (中国水稻研究所 杭州 31OOO6) 3 A■要 稻瘟病菌对潮霉素 (HygromycinB．简写为 HmB]较为敏感，当不含无 机 盐 的再 生培养基中 HmB旅度达到 loo~g／ml时，稻瘟病菌 2539w 原生质体的再生 即 被 完全 制。我们利用带有 HmB抗性基因的质粒 (p^N7一t)，通过 PEG 融合法对其原生质体进 行转化 ，获得了 HmB抗性转化子 。转化子以两类形式 出现 ：一类为大而生长稳定的菌落 ；另 一 类为小而生长不稳定的菌落，两类菌落产生频率分别为每 ~gDNA3-- 4十和 10—20个。将 大菌落转化于转接到含有 HmB的新培养基上，仍可正常生长 ，但小菌落转化于却不能，说明 前者为真正的转化于而后者为流产转化子。DNA杂交分析显示转化是由于质粒 DNA 整 合 到了 2539w 的染色体 DNA 上，整合可在染色体 DNA 的不同位点上发生。受试的 7个转 作为重要的水稻病原真菌，其形态、分类和病理等方面已为人们广泛研究，然而其较高 的变异性及其有性世代的不稳定性 ，决定了用经典的遗传学方法研究其遗传特性较为困 难 “|10】，因此人们对其遗传背景了解很少。DNA 介导的真菌转化技术的发展，为真菌分 子遗传学的研究提供了有力的手段，目前已有多种真菌的转化获得了成功 。早期的转化 系统主要依赖于 (营养)缺 陷型突变体的互补作为选择手段 ，而这些系统对一些缺乏合适 的缺 陷型突变体的真菌却不适用 ，水稻稻瘟病菌便是其中之一 。尽管已有利用 ArgB 基 因转化精氨酸缺陷型突变体的报道 ，但它更需要一种可在其原养型中进行筛选 的标 记。HmB抗性是其中较为理想的一种抗生素抗性标记。HmB是一种氨基糖苷 类 抗 生 素 ，可通过与 70S和 80S核糖体结合干扰蛋 白质合成而抑制原核和真核生物细胸 的生 长 ，但可由 HmB抗性基因 (^ )编码的 HmB磷酸转移酶经磷酸化而失去作用 ∞， 从而使带有 hph基因的细胞获得 HmB抗性。该标记已在多种植物病原真菌转化中得 到了应用 。 Punt等 l987年构建了大肠杆菌 ／真菌穿梭质粒 pAN7一l，该质粒带有 一 个与构巢曲霉 (Aspergillu；#idula#$)基因表达序列相连接 的大肠杆菌 hph基 因，不 仅可在构巢曲霉和黑曲霉 (Aspergillusniger)中表达，也可在其它丝状病原真菌如小 麦颖枯病菌 (Septorianodorum) ，粟长蠕孢菌(Helmiuthosporium setariae)m，番茄叶 霉病菌 (~uluia：alua)“ 中表达，说明该质粒可用于转化不同的丝状真菌，我们利用该 质粒在稻瘟病菌 中建立 了一个转化体系，本文报道转化的结果。 0 车支于 1992年 8月 15臣收到。 圆 PEG 为 PolycthFl~u~glycol的缩写，是聚乙二醇 维普资讯 遗 传 学 报 l 材辩和方法 1．1 菌株与培养基 转化受体菌为 2539w；固体平板培养基、扩大培养液及菌体培养按王金霞等 所述； 生孢培养基：燕麦 50g／L(煮后去碴)，蔗糖 5g／L，琼脂 16g／L。 1．2 质粒 用于转化的质粒 pAN7—1(6．5kb) 由 Punt博士提供，该质粒所带的大肠 杆 菌 ^鲫 基因上游和下游分别与构巢曲霉 3一磷酸甘油醛脱氢酶基 因 (gpd)启动 子 和 }坤c 转录终止序列连接而能在真菌中表达。将 pAN