分子克隆技术第二章.docVIP

第二章基因工程的工具酶 第一节限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶的发现 Restriction endonucleases Restriction-modification systems occur in many bacterial species, and constitute a defense mechanism against the introduction of foreign DNA into the cell. They consist of two components; the first is a restriction endonuclease, which recognizes a short, symmetrical DNA sequence, and cuts (hydrolyzes) the DNA backbone in each strand at a specific site within that sequence. Foreign DNA will hence be degraded to relatively short fragments. 2017/2/21 有关的几个概念 限制 (restriction) 修饰 (modification) 宿主控制性限制(host—controlled restriction) 限制性核酸内切酶的生物学功能 The second component of the system is a methylase, which adds a methyl group to a C or A base within the same recognition sequences in the cellular DNA. This modification renders the host DNA resistant to degradation by the endonuclease.  Restriction endonucleases ? Restriction endonucleases are bacterial enzymes which cut (hydrolyze) DNA into defined and reproducible fragments. In bacteria, they form part of the restriction-modification defense mechanism against foreign DNA.They are the basic tools of gene cloning.  二、限制性核酸内切酶的分类 核酸酶 核糖核酸酶（RNase） 脱氧核糖核酸酶（DNase） 核酸外切酶（exonuclease） 核酸内切酶（endonuclease）  1  二、限制性核酸内切酶的分类 1、Ⅰ型限制性核酸内切酶 类型I限制性内切酶属于复合核酸酶，既具有内切酶的活性又具有甲基化酶的活性 Messelson 、Yuan EcoK EcoB: T- G - A - N8 - T- G - C - T 5`---- TGA*NNNNNNNN T GCT--------- 3` 3`---- ACT MMMMMMM A*CGA--------- 5` 约1000bp 切割 (2)Ⅱ型酶的识别与切割顺序 II型酶的识别序列一般是4-6个碱基，也有6个以上的，但没有4个以下的，这些序列具有双重螺旋对称的结构 形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构。 EcoR Ⅰ： 5`------- GAATTC------ 3` 3`------- CTTAAG------ 5` ②5`粘性末端（sticky/cohesive end/termini) EcoR Ⅰ： 5`---- GAATTC--- 3` 5` ---G AATTC ---3` 3` CTTAAG 5` 3` --- 5` ---- --- --- CTTAA G 2017/2/21 2、Ⅱ型限制性核酸内切酶 （1）一般性质 一般是37℃ HaeⅢ 70 ℃、 SamⅠ25 ℃、 TaqⅠ65 ℃ 牛血清白蛋白（BSA）和二硫苏糖醇（DTT） 1单位酶活性(1unit 1U)： 星活性(star activity)：EcoR Ⅰ* ①平末端（blunt/flush end/termini) HaeⅢ： 5`---- GGCC----- 3` 5`---- GG CC----- 3` 3` CCGG 5`