分子克隆技术第六章.docVIP

2017/2/21  第六章基因文库技术 (The technology of gene libraries) 二、基因组文库 genomic library） 1、基因组文库的概念 将某种生物的全部遗传组成（DNA）切成适当长度的片段，连接在载体上，转化到宿主细胞中而构建的基因文库，就称为基因组文库。  一、基因文库(Gene libraries) 汇集着基因组所有的DNA序列的重组体DNA群体为基因文库(Gene libraries) 或基因库(Gene libraries) ，DNA文库(DNA libraries)。 由基因组DNA所制成的基因文库称为基因组文库 (genomic libraries )，由互补DNA所制成的称为cDNA文库(cDNA libraries )。 (bank，libraries， pool，reservoir) 2、构建基因组文库的步骤 Preparation genomic DNA Producing DNA fragment by restriction endonucleases Creating recombinant DNA by ligase Transformed into competent cell Screening the target DNA  为了要分离到一个确实含有目的基因的克隆，究竟要筛选多少个重组体克隆呢？  3、基因组文库的大小 1976年，L.Clark和J. Carbon提出了一个经验公式： N=ln(1-p)/ln(1-x/y) N: 完全基因文库所应包含的重组DNA的转化子克隆数（基因文库大小） P：在重组体群体中出现目的基因序列的概率（一般为99%） X：文库中每个克隆所含的外源DNA片段的平均长度 Y：该生物基因组的大小（单倍体基因组长度）  1  举例： 为了获得猪垂体生长激素 PGH 基因，用猪垂体细胞分离制取构建 PGH 基因文库时，用上式计算，X：插入的DNA片段平均长度16kb, Y：单倍体长度3.30×106kb， N=9.67×105个，如果实验中得到106个重组噬菌体，符合基因组文库大小的要求，即99%可能筛选出所需的PGH基因。 2017/2/21 三、cDNA文库 1、概念： 通过一系列的酶催作用，使总Poly(A) mRNA 转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化给大肠杆菌寄主菌株的细胞内。如此便构成了包含着所有基因编码序列的cDNA基因文库。  2、cDNA文库构建的具体步骤 总RNA的完整性的鉴定  分离细胞总RNA,然后从中纯化出主要含mRNA的部分 合成第一链cDNA oligo(dT)引导的cDNA合成法、随机引物引导的cDNA合成法 将 mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子自我引导合成法、RNaseH酶降解取代法 将 cDNA甲基化及加连接子 将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上 导入寄主细胞增殖 ? 用纤维素柱纯化poly(A) mRNA的流程示意图  2 2017/2/21 ? libraries 以λ噬菌体构建cDNA文库  3 2017/2/21  3、cDNA文库的库容量计算： ln(1-P) N= ln(1-n/T) P为文库中包含细胞中任何一种mRNA序列信息的概率,通常设为99%; N为文库中以P概率出现细胞中任何一种mRNA序列理论上应具有的最少重组子克隆数; n为细胞中最稀少的mRNA序列的拷贝数; T为细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数.  4、cDNA文库的优点 1、cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病 毒来说非常适用。因为它们的增殖并不经过DNA中间体。 2、cDNA基因文库的筛选简单易行。 3、每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中 出现假阳性几率比较低。 4、克隆在细菌中表达的基因和基因序列结构的测定。 5、表达序列标签的研究（expressed sequence tags, EST)  5、cDNA文库的应用 用于筛选基因。通过cDNA文库筛选获取较为完整的cDNA片段。 构建表达型cDNA文库,通过筛选特异性表达蛋白质分离基因。 用于分离发育阶段特异性及组织特异性基因。  4