CTAB法提取植物基因组DNA.docVIP

CTAB法提取植物基因组DNACTAB法原理 CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide），十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去(0.7mol/L NaCl)， CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。 主要试剂与溶液的配制： PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30） 巯基乙醇 氯仿︰异戊醇（24︰1） 异丙醇 70%乙醇 Tris-苯酚 RNaseA 无水乙醇 CTAB 溶液：CTAB——20g/L NaCl（58.44）——1.4 mol/L（81.816g） EDTA（292.25）——10 mmol/L（2.9225g） Tris（121.14）——100 mmol/L（12.114g） pH 8.0 1×TE 缓冲液：EDTA（292.25）——1 mmol/L（0.29225g） Tris（121.14）——10 mmol/L（1.2114g） pH 8.0 NaAC溶液：NaAC（82.03）——3mol/L（246.09g） pH 4.0 植物总DNA的提取 1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转入10mL的离心管中，放入液氮或-80℃冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差几倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。 2、将（200ml）CTAB溶液放于65℃水浴锅中预热。 3、加4ml巯基乙醇到预热的200mlCTAB中。 4、速加3ml预热的CTAB到装有粉末的10mL离心管中，之后放入65℃水浴锅中，保温30~60min，期间轻摇数次（一般20min左右一次，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔）。 5、加入3~4ml氯仿︰异戊醇（24︰1）（在通风橱中操作），轻摇混匀至乳白色（100~200次，剧烈晃动会使DNA机械切割）。 6、15~20℃，11000 rpm离心15min（CTAB配平，相对应的离心管，质量相差0.03g）。 7、取上清（用剪过的枪头进行操作，过尖的枪头会把DNA链弄断。），加0.6倍体积的异丙醇，摇均（有絮状物析出，可放入4℃冰箱过夜）。 8、用毛细玻璃管将DNA絮状物挑出（DNA絮状物尽量要挑出，不要离心，因为离心后虽然产量会增大，但是不完整的DNA也增多）（或4℃，10000 rpm离心5min，弃上清），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，放置超净台中吹干。 9、加入2ml 1×TE缓冲液溶解，可放入4℃冰箱保存（酶活性在4℃或65℃水浴中最低，防止酶降解DNA）。 10、未溶解的，可放入65℃水浴中促其溶解，10min后拿出冷却至室温，可重复，直至溶解。 11、加入2.5ul RNaseA（RNaseA提前拿出融化），10℃离心，升至4000 rpm即停，使RNaseA和溶液充分混合。 12、37℃水浴，保温1h。 13、加入1ml Tris-苯酚、1ml氯仿︰异戊醇（24︰1），摇均配平，4℃，11000 rpm离心10min。 14、取上清，加1×TE补至2ml，加2ml氯仿︰异戊醇（24︰1）摇均配平，4℃，11000 rpm离心10min。 15、如仍有白色蛋白质沉淀，则重复步骤14。 16、取上清，加0.1倍上清液体积的NaAC，2.5倍上清液体积的无水乙醇（提前放入-20℃冰箱），摇均，放入-20℃冰箱沉淀30min。 17、用毛细玻璃管将DNA挑出（或用无水乙醇配平，4℃，10000 rpm离心4min，弃上清），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，转入1.5ml离心管，放置超净台中吹干。 18、将DNA 溶于适量的1×TE缓冲液中，短期4℃保存，长期-80℃冰箱中储存。 19、取少量DNA溶液进行琼脂糖电泳，胶浓度为0.8%，检测其完整性。并用紫外分光光度计测其浓度。 注解： 1、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 2、CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 3、NaCl：提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，在于液相中； 4、EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； 5、Tris (