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λ- 噬菌体及质粒载体 ——郭苋 2014212346 噬菌体的一般生物学特性 依赖于寄主细胞存活。脱离了寄主细胞后既不能生长也不能复制。 基本功能： 保护自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭环境化学物质的破坏 将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞 经被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而能产生出大量的子代噬菌体颗粒。 使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒 λ噬菌体载体 1 λ噬菌体的分子生物学概述 2 λ噬菌体载体 1 λ噬菌体的分子生物学概述 λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48 502bp，两端各有12个碱基的5`凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。可用来构建柯斯质粒。 λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。 λ噬菌体基因组编码基因区域 左侧区：自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。 中间区：介于基因J与基因N之间，这个区又称为非必要区。本区基因与保持噬菌斑形成能力无关，但包括了一些与重组有关的基因（redA 和redB）。以及整合到大肠杆菌染色体中去的int基因。和把原噬菌体从寄主染色体上删除出去的xis基因。 右侧区：位于Ｎ基因的右侧，包括全部主要的调控成分，噬菌体复制基因（Ｏ和Ｐ）以及溶菌基因（Ｓ和Ｒ） 注 意 λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因（OL, OR)之间的相互作用来决定的。 如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源周期。 构建λ噬菌体载体的基本原理 野生型的λ噬菌体DNA，对大多数基因克隆中常用的核酸内切酶都有过多的限制位点，通过消除一些多余的限制位点和切除非必要的区段，才可能将它改造成适用的克隆载体。 插入型载体 替换型载体 λ噬菌体载体可分为： 插入型载体 免疫功能失活的插入型载体：载体基因组上存在一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成性阻遏物的功能遭受到破坏，而不能进入溶源周期。因此带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成浑浊的噬菌斑。 Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体 载体基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。 替换型载体 λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。 中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列。因此当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效的提高了克隆外源DNA片段的能力。 λ噬菌体载体的特点 (1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，而质粒最大仅10 kb左右； (3)转化效率高。 注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb ~ 52kb。 体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白 λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。 λ噬菌体载体的改良 围绕三个目的进行： 设计可对重组体分子作正选择的克隆载体， 构建可方便的通过转录作用制备外源DNA插入序列之RNA探针的克隆载体 发展可使插入的真核cDNA与β-半乳糖苷酶形成融合蛋白质的克隆载体。 质粒载体 质粒特点 ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。 ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。 ③质粒对宿主生存并不是必需的，某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存。 质粒载体的种类 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有27种限制性内切酶的单一识别位点。 质粒载体的优缺点 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。 1.与外源DNA重组操作简便； 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， 3.质粒DNA的制备和纯