2013.9-10基因转染技术简介.pptVIP

基因转染技术(Gene Transfection Technique) 主要内容 一、基本概念 二、一般步骤 三、几种基因转染方法 四、影响因素 一、基本概念 转染(transfection) 传统概念 将病毒基因组DNA或RNA，导入容纳细胞(permissive cell)，病毒基因组在宿主细胞内复制、转录和翻译，组装成有感染能力的子代病毒的过程。 现在 将有生物功能的核酸转移到细胞内，并维持其生物功能。 基因组 质粒DNA 纯化的DNA片段 意义 基因结构和功能的分析； 基因表达调控的研究； 基因治疗； 二、一般步骤 1. 准备待转染细胞； 2. DNA的纯化 ； 3. 转染方法的选择； 4. 转染后细胞的筛选； 1. 准备待转染细胞 种类 细胞系：如HeLa、Vero、Cos-7、CHO、CV-1…… 原代细胞 要求 贴壁细胞： 转染前一日：需用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿/瓶，细胞密度以铺满培养器皿60%为宜。 转染当日：转染前4小时，换一次新鲜培养液。 悬浮细胞： 转染前4小时需换一次新鲜培养液。 基因导入细胞后的表达，与受体细胞性状、细胞种类和细胞来源密切相关。 2. 靶基因的选择、DNA的纯化 对用于转染的质粒DNA的要求 纯度高：无蛋白、无RNA和化学试剂污染， OD260/OD2801.8 3. 转染方法的选择 瞬时转染(transient transfection)： 目的基因不整合进宿主基因组、多拷贝/C、高表达、时间短(24-96hr)； 报告系统辅助检测：如荧光蛋白、β半乳糖苷酶等 多用于启动子和其它调控元件的分析 稳定转染：目的基因整合进宿主基因组； 病毒载体导入法：逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒载体等 需要利用选择性标记(基因)反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 新霉素抗性基因：编码细菌磷酸转移酶，可使筛选药物G418失活 潮霉素B磷酸转移酶（HPH） 胸苷激酶（TK） 4. 转染后细胞的筛选 根据不同基因载体中所含有的抗性标志基因选用相应的药物； 最常用的真核表达基因载体的标志物： 潮霉素（hygromycin） 新霉素（neomycin）/G418 三、几种基因转染的方法 1. 磷酸钙共沉淀法 先将CaCl2、DNA混合，然后加入到磷酸盐缓冲液(PBS)中，慢慢形成DNA磷酸钙微沉淀，将混悬液加入细胞上，微沉淀附着于细胞膜，经细胞内吞(胞饮)进入细胞质 转化效率通常很低 2. DEAE(二乙氨乙基)-葡聚糖法 DEAE-葡聚糖与DNA形成复合物，复合物与细胞膜结合后可被吞噬，DNA进入转染细胞 此法对不同细胞的转染效果有差异，转染前要慎重选择待转染细胞的类型 3. 脂质体介导的转染法 目前最为有效的转染方法 优点：简易、对细胞生长影响小 脂质体：由人工制备的磷脂双分子层组成的膜状结构，内部为水相的闭合囊泡结构，可包裹多种物质。DNA与脂质体混合后可被包裹在脂质体的水相中。当脂质体与转染细胞的细胞膜接触时，脂质双分子层与细胞膜融合，脂质体水相中DNA进入细胞内部，细胞被转染。 转化效率比磷酸钙法、DEAE葡聚糖法高5-100倍 4. 电穿孔法(电转、电脉冲介导法) 利用脉冲电场将DNA导入培养的细胞 转化效率比磷酸钙共沉淀法高2~3个数量级 5. 显微注射法： 将靶细胞置于显微镜下，以特制的显微玻璃注射器(毛细管)直接将目的基因注入细胞内。 适合于各种培养的细胞，常用于转基因动物 不适于大量转染细胞； 需要一定的设备和操作技巧。 6. 病毒载体介导法 以病毒为载体，通过病毒感染的方式，将外源DNA 导入到细胞中。 优点：转染效率高、可稳定遗传、使于各种细胞、操 作简单 缺点：有潜在危险，需病毒操作经验和设施； 适用于难以转染的原代细胞； 常用：逆转录病毒、腺病毒、HSV-1等转染系统 四、影响转染效率的因素 1. 转染方法 2. 受体细胞状态 3. 血清 4. 载体构建 5. DNA质量 1. 转染方法 理想方法： 效率高、安全、不影响细胞正常生理功能、方法简单、重复性好、易获得稳定转化子、省时经济 需要优化 DNA与转染试剂比例、细胞数量、培养及检测时间等。 2. 受体细胞状态 健康的细胞是成功转染的基础。 不同细胞有不同的培养基、血清和添加物。 高的转染效率需要一定的细胞密度，一般在转染前24小时将细胞传代，以提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。 要避免细菌、支原体或真菌的污染。 3. 血清 血清质量直接影响转染效率。 使用对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清。 有些转染技术(如脂质