实验四）植物病原真菌的DNA提取及检测.PDF

实验四） 植物病原真菌的DNA提取及检测 实验四） 植物病原真菌的DNA提取及检测 DNA 的提取、纯化原理： 破坏细胞壁和细胞膜系统，释放基因组DNA ；除去大部 分杂质(蛋白、多糖) ；抑制 DNase 活性；维持离子平衡；沉 淀和洗涤DNA 。 电泳检测原理： DNA在碱性的溶液中带有负电荷，在电场作用下朝正极 移动；琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA 分子迁移 的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。 goldenview可插入到DNA 分子的双链中。在紫外光的照射 下， DNA 呈绿色荧光，可以指示DNA含量和位置。 1. 菌丝的制备 1. 菌丝的制备 取菌丝体生理盐水洗 次，无菌滤纸吸干，-20℃ 储藏备用。 直接取平板上生长的 菌丝，-20℃储藏备 用。 2.病原菌DNA的提取——尿素法 2.病原菌DNA的提取——尿素法 称取0.05g菌丝，用-20 ℃冰冻研钵研磨至粉碎 ℃ 称取0.05g菌丝，用-20 冰冻研钵研磨至粉碎 加入1mL尿素抽提液，混匀后装入1个dorf管中。 加入1mL尿素抽提液，混匀后装入1个dorf管中。 离心12000rmp，5min 离心12000rmp，5min 加入700uL酚/氯仿/异戊醇，用力震荡数次 加入700uL酚/氯仿/异戊醇，用力震荡数次 离心12000rmp，5min 离心12000rmp，5min 弃下相 取上清500uL转移至新管 弃下相 取上清500uL转移至新管 加入500uL异丙醇和50uL的3M NaAc颠倒数次 加入500uL异丙醇和50uL的3M NaAc颠倒数次 -20℃冰浴，20min -20℃冰浴，20min 离心12000rmp，5min 离心12000rmp，5min 加入70%的乙醇200uL洗涤 弃上清,倒置dorf 加入70%的乙醇200uL洗涤 弃上清,倒置dorf 管，使液体流净 管，使液体流净 室温放置5-10min 室温放置5-10min 加入20uL三蒸水 加入20uL三蒸水 -20℃保存备用 -20℃保存备用 2.病原菌DNA的电泳检测 2.病原菌DNA的电泳检测 （二）病原菌DNA的ITS片段的PCR扩增及检验 （二）病原菌DNA的ITS片段的PCR扩增及检验 通用引物： 通用引物： ITS1:5TCCGTAGGTGAACCTGCGG3 ITS1:5TCCGTAGGTGAACCTGCGG3 ITS4:5TCCTCCGCTTATTGATATG3 ITS4:5TCCTCCGCTTATTGATATG3 反应体系：