两种单光子雪崩二极管（SPAD）在荧光寿命成像（FLIM）.PDFVIP

两种单光子雪崩二极管(SPAD) 在荧光寿命成像(FLIM)中的应用 荧光寿命成像 (FLIM)在普通强度成像的基础上增加了一个时间维度，可以观察荧光衰 减特性以及空间差别。FLIM 可以分辨染色荧光蛋白（比如GFP 与YFP ）与自体荧光，并 且不受荧光强度变化的影响。可以通过探测局部状况（诸如水浓度、pH 值）来确定离子浓 度（比如Ca2+ ），分辨DNA 与RNA。 记录必要的时间相关的数据可以选择时间相关单光子计数（TCSPC ）技术，该技术灵 敏度高达单分子水平，可以探测皮秒时间精度。TCSPC 只是与FLIM 匹配的选择之一。可 以结合单光子雪崩二极管(SPAD)与短脉冲激光器获得高灵敏度与高时间分辨率。FLIM 的时 间分辨性能通常用仪器响应函数（IRF ）表示，IRF 依赖于激光脉冲宽度、光子计数探测器 的时间分辨率以及TCSPC 的时间分辨率。其中最主要的是探测器，半导体激光器脉冲宽度 可达 100ps 以下，TCSPC 比如PicoHarp 300 的时间分辨率小于12ps rms。美国Perkin Elmer 的SPCM-AQR 型SPAD 时间分辨率大于300ps，大大高于好的光电倍增管的时间 分辨率，并且探测器脉冲的瞬时位置依赖于探测光子的总数（计数率），这对于 FLIM 测量 很成问题。 现在意大利MPD 公司的新一代PDM 系列SPAD 探测器克服了这个问题，其时间响应 特性可与微通道板MCP 相媲美，其 IRF 几乎与计数率无关，因此非常适合FLIM 测量。 o. 实验原理 C s ie g lo 以下是雏菊花粉颗粒FLIM 自体荧光成像的一个例子，皮秒半导体激光器发出的波长为 hno 532nm 的激光束激发样品后，产生的荧光通过 540~610nm 的带通滤光片进行探测。使用 c Te 时间分辨共焦荧光显微镜 MicroTime 200 进行测量，可以在单分子水平上进行荧光蛋白浓 C 度的 FLIM 测量。使用两个不同的 SPAD 探测器通道：MPD 的探测直径范围为 50um 的 S T E PDM 50 型 SPAD 以及 Perkin Elmer 的探测直径范围为 180um 的 SPCM-AQR-14 型 SPAD。由PicoHarp 300 TCSPC 模块进行记录成像，通过SymPhoTime 软件来获得数据 采集与分析。 测试结果与成像分析 o. C s 图 1 ie g lo o 图 1 为上述装置的荧光寿命成像图，左图使用的是PDM SPAD