通过点突变提高L-天冬酰胺酶的酶活及热稳定性-食品与生物技术学报.doc

通过定点突变提高枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的活力及稳定性 （1. 江南大学生物工程学院, 工业生物技术教育部重点实验室, 江苏 无锡 214122；2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏 无锡 214122） 摘 要：L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。它可以通过降解食品原料中的L-天冬酰胺而降低高温烹制食品中丙烯酰胺的含量。由于食品预处理环境的复杂性,只有具有高酶活且稳定的酶才能满足食品生产中的应用。本研究通过点突变提高来源于Bacillus subtilis B11?06的L-天冬酰胺酶（BsAII）的酶活和热稳定性。通过序列比对和同源模拟选择个点进行突变,构建个突变菌株。酶活测定结果表明,突变体酶S299N和P348A的酶活较BsAII分别提高28%和32%。其中P348A的热稳定性和pH稳定性较BsAII均有明显提高。本研究表明第299和348位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响,对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础,并提高了该酶的工业应用潜力。 中图分类号：Q789  L-天冬酰胺酶II(L-Asparaginase II,EC 3.5.1.1)可以催化L-天冬酰胺脱氨基成L-天冬氨酸和氨,该酶具有抗肿瘤活性,已被应用于治疗急性淋巴细胞白血病及霍金森病等。最新报道该酶也可用于减少高温制作食品中丙烯酰胺的生成。近年来,丙烯酰胺由于对人体潜在的致癌作用而引起人们的关注。丙烯酰胺在高温烘烤及油炸食品中含量较高,它主是由天冬酰胺和还原糖通过美拉德反应生成。美拉德反应是一种普遍的非酶褐变现象,是油炸及烘烤食品色味的主要是形成途径。研究表明,天冬酰胺酶通过将天冬酰胺转化天冬氨酸有效降低食品中丙烯酰胺的含量其色味。 目前由Aspergillus oryzae 和Aspergillus niger所产的天冬酰胺酶由于其优良特性已被人们普遍接受,如在pH 6.0～7.0,60 条件下有较高的酶活。但是由于高温、强酸碱、高盐、溶剂毒性等复杂的食品预处理环境,只有高酶活,耐高温,耐酸碱的天冬酰胺酶才具有较高的应用价值。 本实验室前期研究工作中将来源于枯草芽孢杆菌中的L-天冬酰胺酶II（BsAII）基因通过表达质粒载体pMA5在Bacillus subtilis 168中实现过量表达,经发酵优化后在5L发酵罐中酶活达到89.48 U/mL。Gilbert将来源于Erwinia chrysanthemi中的天冬酰胺酶基因在E. coli 和Erwinia carotovora中实现重组表达酶活分别为49和20.2 U/mL[8,9]。Hatanaka等克隆来源于Streptomyces中的天冬酰胺酶基因并在E. coli 中实现重组表达酶活达到23.02 U/mL。因此与其它研究相比,本实验室的重组菌所产天冬酰胺酶具有更高酶活,并且枯草芽孢杆菌为GRAS 菌株,已被广泛应用于食品发酵行业,其安全性已得到广泛认可。但是与已经工业化的天冬酰胺酶相比,本实验室得到的L-天冬酰胺酶II的酶活和热稳定性还有待提高。 蛋白质工程是用于克服天然酶在工业应用过程中缺陷的重要手段。通常改造蛋白的策略主要包括定点突变、定向进化等。II型L-天冬酰胺酶属于同源四聚体,相邻两个单体形成两个活性中心区域。每个催化中心由一个单体的C端与相邻单体的N端区域形成。虽然每个“二聚体”都有两个活性中心区域,但只有具有四聚体结构的酶才有酶活。由此,我们推断在该蛋白三维结构中距离酶催化活性中心区域较近的氨基酸残基对酶的稳定性和酶活可能具有重要的影响。近年来,研究者已经对天冬酰胺酶的催化机理进行了深入的研究。通过不同来源的天冬酰胺酶的晶体结构并结合点突变研究明确了该酶的催化活性中心位点,例如,来源于E.coli 的天冬酰胺酶的活性位点分别为：T12、Y25、S58T89、D90 、K162。通过序列比对发现不同来源的天冬酰胺酶的活性位点高度保守。因此,我们决定采用定点突变手段改造L-天冬酰胺酶II提高其酶活和热稳定性,以提高其工业应用价值。我们采用序列比对和同源模拟来选择突变位点。试验结果表明突变体酶S299NanszP348Aansz的酶活和稳定性较原始都有所提高。 1 材料与方法 1.1 材料 pMA5载体,大肠杆菌JM109、枯草芽孢杆菌Bacilus subtilis168由本实验室保存。BamHI、MluI等限制性内切酶,T4 DNA连接酶等购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒,胶回收试剂盒等购自Generay公司。其余为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1定点突变和质粒的构建 以实验室已构建的重组质粒pMA5-ansz为模板,设计两条相互有重叠部分的含突变点的引物,如表1所示,利用突变引物通过重叠延伸PCR引进突变点。 表1 基因克