选3基因工程 第一节.pptVIP

专题1 基因工程 二、 DNA重组技术的基本工具 基本工具： 限制性核酸内切酶——“分子手术刀” DNA连接酶——“分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” DNA连接酶——“分子缝合针” （二） DNA连接酶——“分子缝合针” E·coli DNA 连接酶 T4 DNA 连接酶 DNA连接酶——“分子缝合针” 区别： E·coli DNA 连接酶 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接 T4 DNA 连接酶 既可“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低 基因工程的基本操作程序 (P8) 三、基因工程的基本操作程序 2.利用PCR技术扩增目的基因 3、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 条件：基因比较小 核苷酸序列已知 小结 目的基因的获取  1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、通过化学方法人工合成:(1)反转录法 (2)氨基酸----mRNA----脱氧核苷酸序列（推测）----化学合成 (3)通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成（条件） （4）PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次重复循环，每次循环可以分为三个基本步骤──高温变性（ 90℃ -95℃）、低温复性（ 55℃ -60 ℃ ）和适温延伸（ 70℃ -75 ℃ ） ①高温变性（ 90℃ -95℃） （模板DNA解旋） 模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解链为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备. （5）循环过程 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步 ：加热变性(90-95℃) ②低温复性（ 55℃ -60 ℃ ） （退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到55-600C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 PCR扩增仪 靶序列 靶序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：引物与靶序列结合(55-60℃) ③适温延伸（ 70℃ -75 ℃ ） DNA模板——引物结合在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则，合成一条新的DNA链. 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸(70-75℃) 靶序列 靶序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 1,048,576 20 1,073,741,824 30 8 3 4 2 2 1 DNA数量 循环次数 30次循环后靶序列扩增的数量 PCR 循环的结果 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增; ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸; 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 （二）基因表达载体的构建 ─基因工程的核心 2.结构组成： 3.启动子： 4.终止子： 5.标记基因： 1.目的： （二）基因表达载体的构建 ─基因工程的核心 使目的基因在受体细胞中中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 启动子、目的基因、终止子、标记基因等 位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动转录的开始。 位于基因的尾端，控制转录的结束。 作用是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因。 * * * * 1.什么叫基因？ 思考讨论 3.遗传信息是如何表达的？ 2.基因、DNA、染色体 之间是怎样的关系？ 非编码区 非编码区 编码区 编码区下游 编码区上游 RNA聚合酶结合位点 调控遗传信息的表达 基因的结构 （原核细胞） RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚