香石竹环斑病毒探讨综述.docVIP

香石竹环斑病毒的研究综述 　　摘 要：香石竹环斑病毒由Kassanis（1955）首次描述，其因在香石竹叶片上形成环斑而得名。本文综述了香石竹环斑病毒的的生物学研究以及分子检测。CRSV侵染香石竹的叶、茎、花，造成香石竹花朵变小、花苞开裂、生长衰弱等危害，从而使其商品价值受损降低。过去，由于我国香石竹栽培面积较小，故研究较少、随着栽培面积的扩大和病毒危害程度的日趋严重，近几十年已有香石竹斑驳（于嘉林，1988），香石竹脉斑驳和香石竹潜隐（姜晓春，1989）病毒的报道。于1992年被国家列为检疫对象 关键词：香石竹环斑病毒；生物学研究；分子检测；研究综述 香石竹环斑病毒广泛分布在世界各香石竹种植区中，国外对其研究较广，已有明确报道的如香石竹斑驳病毒、香石竹环斑病毒、香石竹脉斑驳病毒香石竹蚀环香石竹潜隐等多种病毒 1生物学研究 1.1地理分布及寄主范围 广泛分布于温带香石竹种植区，在自然条件下侵染香石竹。机械侵染可侵染25科130多种双子叶植物。在苋色藜上产生局部退绿斑坏死；豇豆局部斑；昆诺藜C.equinoa局部坏死斑；豆芽局部坏死斑；千日红先局部坏死斑。高雪轮系统环斑；心叶烟及普通烟有报道产生局部斑；克利兰夫烟系统侵染；美国石竹接种叶片产生环斑或半环形斑 1.2传播方式 经由无性繁殖材料和根接触传播，汁液能接种，昆虫不传播，有报道可经线虫传播，未发现种传 1.3株系及稳定性 未见有报道有关寄主反应不同的株系。根据病毒粒子在提纯溶液中的凝集形成不同，可分为3个株系：CRSV A， R和N. 其中A株系为12个粒子组成的较稳定的聚合体，温度对其影响不大，N和R株系病毒粒子凝集形式则受温度、PH值和化学试剂的影响。3种株系有血清学相关，有报道仅有14天 1.4血清学研究 CRSV具有很好的免疫原性，凝胶扩散板测得其效价1/1024，血清学反应表明CRSV与香石竹斑驳、烟草环斑、烟草坏死、香石竹蚀环、香石竹意大利环斑等35种球形病毒无血清学相关性 2分子检测的方法 2.1 CRSV的繁殖和纯化 用摩擦接种方法将CRSV接种于苋色藜叶片上，进行繁殖，然后参照[11，13，14]的方法提纯病毒 2.2 病毒核酸的提取 用蛋白酶K消化结合苯酚、氯仿抽提进行纯化 2.3 cDNA的合成及克隆 RNA的3端多聚腺苷化按Carrington的方法进行.cDNA的合成、克隆、转化，重组质粒的筛选等均按照文献[10]的方法进行 2.4 CRSV分子检测 2.4.1 核酸探针的制备 a. 放射性探针的制备：用缺口平移法进行； b. 光敏生物素探针的制备： 参考马立人等制备. 方法：取 10μl（5μg）重组质检与20μl（20μg）光敏生物素混匀，强光照射30分钟，然后用等体积正丁醇抽提2次，再用无水乙醇沉淀3小时，离心后收集沉淀物，吹干后溶于适量双蒸水中即可 2.4.2 点样 先将硝酸纤维膜（NC膜）用2XSSC溶液均匀润湿后，37℃烘干，然后将待测样品及时照样品分别点在NC膜上，80℃烘烤2小时备用 3结果与讨论 3.1 放射性探针杂交结果 cDN A探针与健株汁液， TMV、CMV、 BNYVV RNA 无阳性反应，与CRSV的 RN A有强的信号，说明所制备的cDN A对CRSV的RNA有特异性，检测RNA的极限为1ng； 3.2 光敏生物素 cDN A探针杂交结果 显色反应5分钟，NC膜阳性对照即显示出蓝紫色杂交斑，10分钟后含有CRSV的粗汁液以及CRSV的RN A都表现出明显的蓝紫斑，而阴性对照始终没有反应，证明光敏生物素标记的cDN A探针检测 CRSV准确性好，而且结果直观明显，易于鉴别，检测RNA极限也为 1ng/ml. 用核酸探针来检测病原物，在口岸动植物进出检疫中将大有可为。但是，自从美国Langer等人最早应用生物素制作探针以来，人们越来越重视用非放射性物质来作为探针标记物的研究：从利用缺口翻译简化到直接采用光照的方法，使生物素与待标记的核酸共价结合。与同位素相比，采用光敏生物素标记制作探针具有其明显的优越性：一是没有放射性同位素半衰期短，来源及操作、废物处理不便以及对人体的危害性等缺点；二是灵敏度高；三是制成的探针稳定性好，-20℃时可保存一年左右；四是杂交时间短，且制备这类探针不需要昂贵的试剂，非常适宜口岸检疫的要求，它必将成为口岸检疫的有力工具 3结语 香石竹是世界上仅次于郁金香和玫瑰的第三大鲜切花，也是我国最主要的鲜切花。由于我国对香石竹病毒的研究起步较晚，而近几年其培育规模又在迅速扩大，已经受到严重影响，造成巨大的经济损失。本文结合国情在多方面收集资料